一种胶体金免疫层析卡的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种胶体金免疫层析卡的制备方法，包括底板、上样垫、胶体金结合垫、层析膜和吸样垫，上样垫、胶体金结合垫、层析膜和吸样垫依次粘贴在底板上，所述胶体金结合垫为包被胶体金标记DMD抗体的玻璃纤维膜或聚酯膜，所述层析膜为包被DMD抗体的硝酸纤维素膜,本发明专利技术对DMD基因的79个外显子、两侧相邻50bp内含子序列和已知位于内含子区突变附近序列设计并合成探针，DMD基因相关致病突变序列进行富集(外显子与内含子突变、包括了点突变和结构重排、已知突变和未知突变)构建蛋白抗体。

【技术实现步骤摘要】
一种胶体金免疫层析卡的制备方法
本专利技术属于胶体金免疫层析卡
，具体涉及一种胶体金免疫层析卡的制备方法。
技术介绍
假肥大性肌营养不良（DMD），也称Duchenne型肌营养不良症（DMD）(OMIM310200)，是最常见的一类进行性肌营养不良症，患病率为3.3/10万，占出生男婴的20-30/10万，为X-连锁隐性遗传，主要是男孩发病，女性为致病基因的携带者，通常5岁左右发病，肌萎缩是进行性的，这是本病的特点，预后差，目前对DMD缺乏有效的治疗，肌营养不良症尚无特效药物和根治方法,包括基因疗法和施用皮质类固醇。现有的肌肉活检是能明确诊断是何种DMD基因突变类型，而且能区别是DMD还是BMD，也被作为临床诊断的“金标准”，其缺点具有一定的创伤性。基因检测(多重PCR，MLPA，Sanger测序和高通量测序)虽然能够无创性的并可提供多种信息的检测手段，但检测难度和费用均较大，上述检测方法在生物医学研究及法医学应用实践中存在的突出问题是：只能检出部分突变类型，检出率低，检测周期长；且对人有一定创伤。基因检测虽然检出率高但价格昂贵，普通家庭难以承受的问题，为此本专利技术提出一种胶体金免疫层析卡的制备方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种胶体金免疫层析卡的制备方法，以解决上述
技术介绍
中提出的现有的肌肉活检是能明确诊断是何种DMD基因突变类型，而且能区别是DMD还是BMD，也被作为临床诊断的“金标准”，其缺点具有一定的创伤性。基因检测(多重PCR，MLPA，Sanger测序和高通量测序)虽然能够无创性的并可提供多种信息的检测手段，但检测难度和费用均较大，上述检测方法在生物医学研究及法医学应用实践中存在的突出问题是：只能检出部分突变类型，检出率低，检测周期长；且对人有一定创伤。基因检测虽然检出率高但价格昂贵，普通家庭难以承受的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种胶体金免疫层析卡的制备方法，包括底板、上样垫、胶体金结合垫、层析膜和吸样垫，上样垫、胶体金结合垫、层析膜和吸样垫依次粘贴在底板上，所述胶体金结合垫为包被胶体金标记DMD抗体的玻璃纤维膜或聚酯膜，所述层析膜为包被DMD抗体的硝酸纤维素膜。优选的，所述层析膜的两端分别搭接有吸样垫、胶体金结合垫，所述胶体金结合垫的另一端搭接有上样垫，所述上样垫搭接压住胶体金结合垫的1/4，所述胶体金结合垫搭接压住层析垫的1/5，所述吸样垫搭接压住胶体金结合垫的1/12。优选的，包括以下步骤：胶体金溶液制备：向100mlHauCl4的0.01％水溶液中加入1％柠檬酸三钠水溶液2.00—4.50mL，混匀煮沸，保持沸腾30min得到直径为5-20nm的胶体金溶液；胶体金结合垫制备：将胶体金溶液调至pH7.0-9.0后加入6μg/mL-15μg/mLDMD抗体和封闭剂，10000rpm离心30min，将离心下来的沉淀复溶至含有BSA、蔗糖的胶体金溶液中，将复溶产物加至玻璃纤维膜或聚酯膜后干燥；层析垫制备：将DMD抗体用0.01M，pH为7.4的PBS稀释成0.5mg/mL、1.5mg/mL，羊抗鼠IgG分别稀释成1mg/mL、2mg/mL，检测线J包被DMD抗体，质控线Z包被羊抗鼠IgG，然后用喷膜仪在硝酸纤维素膜上按1.2μL/cm进行划线包被后干燥；试纸卡组装：将已包被的层析膜放置在底板的中部粘贴，在层析膜的T线一侧搭接胶体金结合垫，搭胶体金结合垫的1/5粘贴，在胶体金结合垫另一侧搭接粘贴上样垫，搭胶体金结合垫的1/4粘贴；在层析膜的C线一侧搭接吸样垫，搭吸样垫的1/12粘贴；用裁剪机将贴好的底板切成3～5mm宽的试纸条，再装入塑料卡内，形成试纸卡，任选地，所述封闭剂为1％BSA或0.1％PEG-20000。优选的，所述试纸卡组装是在温度为20～25℃，湿度小于30％的室内完成的。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：（1）本专利技术对DMD基因的79个外显子、两侧相邻50bp内含子序列和已知位于内含子区突变附近序列设计并合成探针，DMD基因相关致病突变序列进行富集(外显子与内含子突变、包括了点突变和结构重排、已知突变和未知突变)构建蛋白抗体。（2）与现有常规检测方法相比，本专利技术所开发的检测试纸卡能够一次性检测DMD基因各种突变信息，具有全面、快速、准确、价格适中的优点。（3）本专利技术提供的检测DMD的免疫层析试纸卡，采用金标免疫层析技术对DMD抗体进行检测，检测中不需要昂贵的仪器和繁琐的操作过程，简化了检测流程，大大缩短了检测周期，检测时间比基因分析方法缩短了许多。附图说明图1为本专利技术的胶体金免疫层析卡结构示意图；图中：1、上样垫；2、胶体金结合垫；3、底板；4、层析膜；5、吸样垫；J、检测线；Z、质控线。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1本实施例提供了一种检测DMD的胶体金免疫层析试纸卡，并提供了该试纸卡的制备方法。一、主要材料DMD特异性配对抗体、羊抗鼠IgG抗体：Abnova公司产品；氯金酸：Sigma公司产品；硝酸纤维素(NC)膜：SARTORIUS(德国)，CN140；德国赛多利斯公司产品；牛血清白蛋白(BSA)，聚乙二醇PEG20000，水解酪蛋白：Sigma产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。二、胶体金的制备方法1、将100mlHauCl4的0.01％水溶液加入1％柠檬酸三钠水溶液2.00—4.50mL，混匀煮沸；2、继续加热煮沸30min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成橙红—红色-紫红。全过程约2～3min，得到直径为5-20nm的胶体金溶液.3、冷却至室温后用蒸馏水恢复至100ml。DMD抗体免疫金标记：用柠檬酸三钠作为还原剂制备直径为5-20nm的胶体金溶液，制备完成后取三份胶体金，分别用0.2MK2CO3将溶液调到pH7.0、pH7.5和pH8.0，然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100ml溶液加入0.5mg、1mg将标记用DMD抗体缓慢滴加到胶体金溶液中，继续搅拌2小时，再加入到终浓度为0.1％的PEG20000或1％的BSA进行封闭20min，标记结束后以10000r/m离心，弃上清，沉淀按50％原体积复溶至不同配比的胶体金工作液中(含BSA、蔗糖，可适当添加表面活性剂)。然后将标记胶体金溶液按1ml溶液铺20cm2的比例加样于玻璃纤维膜或聚酯膜上，在温度37℃真空干燥2～5小时，制成免疫金结合垫。层析垫制备：用0.01MpH7.4PBS将包被DMD抗体稀释成0.5mg/ml、1.5mg/ml，羊抗鼠IgG分别稀释成1mg/ml、2mg/ml，然后用喷膜仪在NC膜上按1.2ul/cm进行分别划线包被，检测线J通过包被DMD抗体形成，质控线Z包被羊抗鼠IgG，包被完成后将NC膜在温度37℃，相对湿度＜30％的干燥间干燥2～5小时。试纸卡组装：在干燥室内，温度20～25℃，湿度小于30％，取塑料底板，将已包被的NC膜放置在塑料本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胶体金免疫层析卡的制备方法，包括底板(3)、上样垫(1)、胶体金结合垫(2)、层析膜(4)和吸样垫(5)，其特征在于，上样垫(1)、胶体金结合垫(2)、层析膜(4)和吸样垫(5)依次粘贴在底板(3)上，所述胶体金结合垫(2)为包被胶体金标记DMD抗体的玻璃纤维膜或聚酯膜，所述层析膜(4)为包被DMD抗体的硝酸纤维素膜。

【技术特征摘要】
1.一种胶体金免疫层析卡的制备方法，包括底板(3)、上样垫(1)、胶体金结合垫(2)、层析膜(4)和吸样垫(5)，其特征在于，上样垫(1)、胶体金结合垫(2)、层析膜(4)和吸样垫(5)依次粘贴在底板(3)上，所述胶体金结合垫(2)为包被胶体金标记DMD抗体的玻璃纤维膜或聚酯膜，所述层析膜(4)为包被DMD抗体的硝酸纤维素膜。2.根据权利要求1所述的一种胶体金免疫层析卡的制备方法，其特征在于：所述层析膜(4)的两端分别搭接有吸样垫(5)、胶体金结合垫(2)，所述胶体金结合垫(2)的另一端搭接有上样垫(1)，所述上样垫(1)搭接压住胶体金结合垫(2)的1/4，所述胶体金结合垫(2)搭接压住层析垫的1/5，所述吸样垫(5)搭接压住胶体金结合垫(2)的1/12。3.根据权利要求1所述的一种胶体金免疫层析卡的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：胶体金溶液制备：向100mlHauCl4的0.01％水溶液中加入1％柠檬酸三钠水溶液2.00—4.50mL，混匀煮沸，保持沸腾30min得到直径为5-20nm的胶体金溶液；胶体金结合垫制备：将胶体金溶液调至pH7.0-9.0后加入6μg...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁翌，林霞，田树伟，
申请(专利权)人：武汉塞力斯生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42