一种miRNA-21的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种miRNA‑21的检测方法，该方法在磁珠上偶联底物链‑蔗糖酶复合物，当靶标miRNA出现后与底物链杂交，双链特异性核酸酶能选择性地裂解在DNA/RNA双链中的DNA并保持RNA的活性，释放的miRNA进行下一轮杂交循环；最后上清液中的蔗糖酶将蔗糖水解为葡萄糖，通过血糖仪检测获得输出信号。本发明专利技术通过引入双链特异性核酸酶和蔗糖酶对miRNA的检测信号进行双酶放大作用，提高了检测灵敏度，在10‑200pM具有线性关系，检测限为1.8pM，具有简便、快捷、灵敏、高效等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种miRNA-21的检测方法
本专利技术涉及微小RNA的检测方法，特别涉及一种miRNA-21的检测方法。
技术介绍
microRNAs(miRNAs)是一类长约18-25nt的内源性非编码小分子，存在于血清、血浆或尿液等体液中，它通过与其靶mRNA分子的3’端非编码区(3’UTR)互补结合，在翻译水平上调控后基因的表达。因此，miRNAs参与生物体多种生理过程，控制细胞分化、增殖和凋亡。然而，由于其在体液中低浓度，短长度和高同源性的特殊性，实现快速，简单，可靠和超灵敏的测定仍具有挑战性。现有miRNA检测方式，大多需要昂贵的仪器设备和复杂的操作、冗长的等待时间。目前用于核酸检测的方法主要有四种：southern和northern印迹法、聚合酶链反应(PCR)、DNA微阵列、新一代测序(NGS)。这些方法普遍具有耗时较长、检测成本较高、需要大型昂贵仪器等的不足，此外对于操作人员专业知识有很高要求。这限制了miRNA检测在家庭和临床上的应用。血糖仪具有小巧易携、价格便宜、方便使用等优点，是目前一种在家庭中广泛使用的血糖浓度测量仪器。双链特异性核酸酶(Duplex-SpecificNuclease，DSN)是一种热稳定核酸酶，不需要特意的识别位点，能够选择性降解双链DNA和DNA/RNA杂交体中的DNA，但对单链DNA/RNA核酸分子和双链RNA分子几乎没有作用，能够区分完全和不完全匹配的双链体。链霉亲和素磁珠既具有磁性，又能进一步和修饰生物素的蛋白质、抗体及核酸等多种生物分子偶联，被广泛应用于免疫沉淀、免疫检测(ELASA)及各类核酸、蛋白质反应。如何利用上述材料的特性，结合化学修饰的技术，研究出可以简便检测miRNA的方法，是值得本行业技术人员思考的。现有技术中的miRNA检测方法检测时间长，操作复杂，还需要使用PCR才能完成检测，或者荧光分光光度计等配合，对技术人员的操作技能要求比较高。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术目的是提供一种检测灵敏度高和选择性高的基于脱氧核酶和蔗糖酶的血糖仪检测miRNA-21方法。技术方案：本专利技术提供一种miRNA-21的检测方法，包括如下步骤：(1)以链霉亲和素修饰磁珠为载体连接底物链(SEQIDNO.1)-蔗糖酶复合物，形成检测探针；所述底物链的结构为5’-生物素-自由链片段1-杂交片段-自由链片段2-3’；所述自由链片段1的序列为：5’-aaaaa-3’；所述自由链片段2的序列为：5’-aaaaaaaaaa-3’；所述杂交片段的序列为：5’-tcaacatcagtctgataagcta-3’；底物链序列为5’-aaaaatcaacatcagtctgataagctaaaaaaaaaaa-3’(SEQIDNO.1)。(2)检测探针弃去澄清溶液后加入待检测miRNA-21(SEQIDNO.2)、DEPC处理水、双链特异性核酸酶缓冲液和DSN，进行反应，待测miRNA-21与检测探针的杂交区域特异性结合，然后底物链中的杂交片段被双链特异性核酸酶裂解，释放miRNA-21，之后进入下一轮杂交循环；(3)将反应溶液进行磁分离，然后将澄清的上清液转移到含有缓冲液A的蔗糖溶液中，进行反应；(4)检测产生的葡萄糖信号，获得葡萄糖浓度值，根据miRNA-21与葡萄糖浓度的线性关系，计算miRNA-21的浓度值。进一步地，所述步骤(2)中的双链特异性核酸酶缓冲液包含50mMTris-HCl，pH8.0，5mMMgCl2和1mMDTT和1μLDSN(1U/uL)。进一步地，所述步骤(4)中利用血糖仪检测产生的葡萄糖信号。应用血糖仪检测，大大降低检测成本和检测时的技术要求：不需要各种工具酶以及多步、复杂难懂的放大步骤，无需冗长的等待时间，大型昂贵的仪器，复杂专业的操作技术，血糖仪读数与标准曲线对照，直接得出miRNA含量，更加简便快捷，适合普通民众使用。进一步地，所述检测探针的制备方法为：(1)制备底物链溶液：用DEPC水配制底物链，加入磷酸钠缓冲液和溶解在DEPC水中的TCEP，将混合物在室温下静置后超滤纯化；(2)制备纯化的sulfo-SMCC活化蔗糖酶溶液：用缓冲液A配制蔗糖酶溶液，与sulfo-SMCC混合；涡旋后，于室温条件置于振荡器上反应，离心除去过量sulfo-SMCC，然后用Amicon-100K和缓冲液A将溶液超滤纯化；(3)制备底物链-蔗糖酶复合物：将纯化的sulfo-SMCC活化蔗糖酶溶液与底物链溶液混合，室温下静置；然后使用缓冲液A、超滤纯化除去未反应的底物链；(4)将底物链-蔗糖酶复合物和链霉亲和素修饰磁珠偶联：向磁珠溶液中加入缓冲液B，室温下混合反应，最后，用缓冲液B洗涤除去未连接的DNA链。进一步地，所述步骤(4)中miRNA与葡萄糖浓度的线性关系为：当miRNA-21浓度在10-200pM范围内符合线性方程y＝2.98+0.12x，其中，y为血糖仪读数，x为miRNA-21浓度。进一步地，所述步骤(3)缓冲液A中含有氯化钠和磷酸钠，pH值7.3。本专利技术方法的原理阐述如下：在磁珠上偶联底物链-蔗糖酶复合物，当靶标miRNA出现后与底物链杂交，双链特异性核酸酶能选择性地裂解在DNA/RNA双链中的DNA并保持RNA的活性，释放的miRNA进行下一轮杂交循环；同时释放的蔗糖酶将蔗糖水解为葡萄糖，通过血糖仪检测获得输出信号。(见图1)。为了克服现有miRNA检测技术中存在的操作复杂、时间冗长、仪器昂贵等缺点，本专利技术新型提供一种基于血糖仪的miRNA检测新方法。血糖仪作为一种被广泛应用的床旁即时检测仪器，具备体积小巧、便携易带、操作简单的优点。为了实现超高灵敏度，应用双链特异性核酸酶循环miRNA及蔗糖酶双酶放大的信号扩大策略。探针以链霉亲和素修饰磁珠为载体，通过生物素偶联底物链。与qRT-PCR不同，整个检测过程可以通过短链核酸miRNA启动，双链特异性核酸酶的选择性地裂解在DNA/RNA双链中的DNA并保持RNA的催化活性作用导致底物链的裂解和蔗糖酶与磁珠的分离。最终，收集到上清液中总蔗糖酶量增加，实现miRNA检测信号的有效放大。第一方面，选用的双链特异性核酸酶(Duplex-SpecificNuclease，DSN)是一种热稳定核酸酶，不需要特意的识别位点，能够选择性降解双链DNA和DNA/RNA杂交体中的DNA，但对单链DNA/RNA核酸分子和双链RNA分子几乎没有作用，能够区分完全和不完全匹配的双链体。第二方面，为了构建由特定序列miRNA启动的反应体系，设计了杂交片段，其含有与靶标miRNA-21互补的靶结合序列(5’-tcaacatcagtctgataagcta-3’)。并且在杂交片段的3’端具有10nt的游离序列，为与蔗糖酶的结合提供足够的空间距离。靶标miRNA通过杂交反应与底物链杂交片段形成双链，底物链中的DNA/RNA杂交双链能够被双链特异性核酸酶裂解，释放出目标miRNA，然后目标miRNA又会返回到下一轮反应，继续与未被裂解的底物链杂交形成DNA/RNA的杂交双链，继续被双链特异性核酸酶裂解，释放出目标miRNA。最终释放出大量蔗糖酶，实现信号的放大作用。有益效果：本专利技术双酶放大效应，可提高miRNA检测灵敏度。相比其他需要加入引物多本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种miRNA‑21的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)以链霉亲和素修饰磁珠为载体连接底物链(SEQ ID NO.1)‑蔗糖酶复合物，形成检测探针；所述底物链的结构为5’‑生物素‑自由链片段1‑杂交片段‑自由链片段2‑3’；所述自由链片段1的序列为：5’‑aaaaa‑3’；自由链片段2的序列为：5’‑aaaaaaaaaa‑3’；杂交片段的序列为：5’‑tcaacatcagtctgataagcta‑3’；(2)检测探针弃去澄清溶液后加入待检测miRNA‑21(SEQ ID NO.2)、DEPC处理水、双链特异性核酸酶缓冲液和DSN，进行反应，待测miRNA‑21与检测探针的杂交区域特异性结合，然后底物链中的杂交片段被双链特异性核酸酶裂解，释放miRNA‑21，之后进入下一轮杂交循环；(3)将反应溶液进行磁分离，然后将澄清的上清液转移到含有缓冲液A的蔗糖溶液中，进行反应；(4)检测产生的葡萄糖信号，获得葡萄糖浓度值，根据miRNA‑21与葡萄糖浓度的线性关系，计算miRNA‑21的浓度值。

【技术特征摘要】
1.一种miRNA-21的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)以链霉亲和素修饰磁珠为载体连接底物链(SEQIDNO.1)-蔗糖酶复合物，形成检测探针；所述底物链的结构为5’-生物素-自由链片段1-杂交片段-自由链片段2-3’；所述自由链片段1的序列为：5’-aaaaa-3’；自由链片段2的序列为：5’-aaaaaaaaaa-3’；杂交片段的序列为：5’-tcaacatcagtctgataagcta-3’；(2)检测探针弃去澄清溶液后加入待检测miRNA-21(SEQIDNO.2)、DEPC处理水、双链特异性核酸酶缓冲液和DSN，进行反应，待测miRNA-21与检测探针的杂交区域特异性结合，然后底物链中的杂交片段被双链特异性核酸酶裂解，释放miRNA-21，之后进入下一轮杂交循环；(3)将反应溶液进行磁分离，然后将澄清的上清液转移到含有缓冲液A的蔗糖溶液中，进行反应；(4)检测产生的葡萄糖信号，获得葡萄糖浓度值，根据miRNA-21与葡萄糖浓度的线性关系，计算miRNA-21的浓度值。2.根据权利要求1所述的miRNA-21的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中的双链特异性核酸酶缓冲液包含50mMTris-HCl，5mMMgCl2和1mMDTT和1μLDSN(1U/uL)，pH值8.0。3.根据权利要求1所述的miRNA-21的检测方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：余伯阳，田蒋为，黄浠桐，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32