一种近红外光荧光蛋白及其融合蛋白制造技术

本发明专利技术公开了一种近红外光荧光蛋白及其融合蛋白，所述近红外光荧光蛋白包括BDFP远红光荧光蛋白的氨基酸序列，并且包括在第113位、125位和127位的氨基酸处的突变，所述BDFP远红光荧光蛋白的氨基酸序列如SED ID NO:1所示。本发明专利技术公开的近红外光荧光蛋白的光谱性质多样，有效亮度高于现有已知的近红外光荧光蛋白，在低pH、高浓度盐酸胍溶液或高温的环境中，都具有优异的稳定性，而且也能耐受光漂白。

【技术实现步骤摘要】
一种近红外光荧光蛋白及其融合蛋白
本专利技术属于荧光标记物
，更具体地，涉及一种近红外光荧光蛋白及其融合蛋白。
技术介绍
远红光(FR)或近红外光(NIR)在动物组织中光吸收和光散射较低，有较高的穿透性，是穿透皮肤等大部分组织的能力最大的光谱区域。具有这类发光色素基团的荧光蛋白更适宜于动物活体组织的深层成像，是活体成像更为理想的荧光标记物。目前该类荧光标记物主要有两种，分子量大小均在35kD左右。一种源自绿色荧光蛋白(GFP),能自催化形成发色团，但是光谱范围有一定局限性，最大荧光发射波长一般在670nm左右，例如标记物TagRFP675。另一种源自存在千细菌中的受体蛋白，细菌光敏色素蛋白(BphP)。BphP主要利用线性四吡咯结构的胆绿素(BV)作为发色团；同时胆绿素BV广泛存在千真核生物体内，这意味着BphP类荧光标记物可应用于活的动物细胞和组织，且无需任何酌或外源辅助因子。BphP类标记物的代表iFP系列和iRFP系列，荧光发射波长范围为670nm-720nm，比如IFP2.0最大荧光发射波长714nm。藻胆蛋白(phycobi1iprotein)存在远红光范围的荧光发射，机制与细菌光敏色素蛋白(BphP)类似，主要源自于非共价结合的藻蓝胆素(PCB)。典型的藻胆蛋白类荧光标记物，例如ApcA、smURFP、ApcF2，它们的最大荧光发射波长为698nm。DingWL等人基于藻胆蛋白体的核心亚基ApcF2的序列，进行基因改造后得到了几种新的荧光藻胆蛋白并将其命名BDFP，这些BDFP蛋白可共价结合胆绿素BV，性能比ApcF2稳定，另外，这些BDFP蛋白的分子最较小，约15kD，最大荧光发射波长为710nm左右。虽然DingWL等人得到的BDFP蛋白很好地弥补了现有的远红光或近红外光的荧光蛋白的上述缺点，但是这些蛋白荧光发射波长比较单一(均在710nm左右)，因此不能有效地组合使用。因此通过基因工程改造，得到亮度更高、光谱性质更为多样和优异的荧光蛋白，具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于克服现有技术中近红外光荧光蛋白种类不多、发射波长较为单一且亮度不够高的技术不足，提供一种近红外光荧光蛋白。本专利技术要解决的另一技术问题是提供一种融合荧光蛋白。本专利技术还一要解决的技术问题是提供编码上述近红外光荧光蛋白或融合荧光蛋白的核酸。本专利技术还一要解决的技术问题是提供一种包括上述核酸的载体。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现：提供一种近红外光荧光蛋白，所述近红外光荧光蛋白包括BDFP远红光荧光蛋白的氨基酸序列，并且包括在第113位、125位和127位的氨基酸处的突变，所述BDFP远红光荧光蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。进一步地，所述近红外光荧光蛋白还包括在第30、50、54、57、76、77、80、81、94、101、108、143和/或151位的氨基酸处的突变。优选地，其特征在于，第113位苯丙氨酸突变为亮氨酸；第125位半胱氨酸突变为甘氨酸；第127位丙氨酸突变为苏氨酸或颉氨酸。优选地，第30位亮氨酸突变为苯丙氨酸；第50位谷氨酸突变为颉氨酸；第54位苏氨酸突变为丝氨酸；第57位丝氨酸突变为甘氨酸；第76位苏氨酸突变为丙氨酸；第77位精氨酸突变为组氨酸；第80位天冬酰胺突变为懒氨酸；第81位甲硫氨酸突变为赖氨酸；第94位丝胺酸突变为天冬氨酸；第101甘氨酸突变为天冬氨酸；第108位精氨酸突变为谷氨酰胺；第143位丙氨酸突变为颉氨酸；第151位丙氨酸突变为苏氨酸。更进一步地，所述近红外光荧光蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2～14任一所示。提供一种二倍串联融合荧光蛋白，采用连接子串联上述近红外光荧光蛋白的氨基酸序列。进一步地，所述连接子序列为GHGTGSTGSGS(SEQIDNO:15)。优选地，所述二倍串联融合荧光蛋白为BDFP1.7:1.7或BDFP1.8:1.8，即两个BDFP1.7蛋白用过连接子连接成为二倍串联融合荧光蛋白BDFP1.7:1.7，或两个BDFP1.8蛋白用过连接子连接成为二倍串联融合荧光蛋白BDFP1.8:1.8.提供一种融合荧光蛋白，所述融合荧光蛋白包括上所述近红外光荧光蛋白或上述二倍串联融合荧光蛋白。进一步地，采用连接子连接上述近红外荧光蛋白与其他蛋白或多肽。优选地，所述连接子的序列为GGGSGGGSGGGSSG(SEQIDNO:16)、GGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSSG(SEQIDNO:17)或MSRRRHSYENDGGQPHKRRKTSPPVAT(SEQIDNO:18)。提供编码上述近红外光荧光蛋白、上述二倍串联融合荧光蛋白或上述融合荧光蛋白的核酸。提供一种包括上述核酸的载体。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了多种近红外光荧光蛋白，发射波长在694nm到705nm左右，且保留了现有BDFP1.6高亮度的特性，提供了一系列光谱性质更为多样的近红外光荧光蛋白。其中，BDFP1.7序列的荧光范围红移至近红外光范围，保留了高亮度的特性，对比BDFP1.1，有效亮度提升至其6.25倍，但是仍不如iRFP720；V6序列的突变体，可明显提升有效亮度，约为BDFP1.7的2.3倍；在V6序列的基础上，得到的BDFP1.8(V10序列)，其有效亮度约为V6序列蛋白的1.4倍，iRFP720的2.4倍。此外，本专利技术进一步提供了通过串联单体结构的BDFP，得到的二倍串联融合荧光蛋白BDFP1.7:1.7、BDFP1.8:1.8，其中BDFP1.8:1.8为单体结构，有效亮度4.4倍于iRFP720。在应用方面，单体结构的荧光蛋白，由于不会影响目标蛋白的化学计量，因而更适合作为蛋白融合标签序列。本专利技术提供的多种近红外光荧光蛋白在低pH、高浓度盐酸胍溶液或高温的环境中，都具有优异的稳定性，而且也能耐受光漂白。近红外荧光蛋白(FPs)是实现深度成像的有力工具，本专利技术为深度成像的荧光蛋白提供的了更多的选择，且本专利技术提供的近红外荧光蛋白可与其他荧光蛋白联合使用。附图说明图1BDFPs荧光蛋白的光谱和亮度比较：(a)BDFPs的吸光度和荧光光谱，蛋白样品经Ni2+亲和层析纯化；(c)相同条件下HEK293t细胞中BDFPs与iRFP720和IFP2.0的有效亮度比较。平均近红外荧光强度归一化为平均eGFP荧光强度。误差条，SEM(n＝3，图像数量)。(d)相同条件下hek293t的有效亮度与近红外FPs分子亮度的比较。将BDFP1.7的有效亮度和分子亮度设为100％。图2BDFP1.8的模拟结构和聚集作用分析。(a)BDFP1.8的模拟结构图，红色表示与光谱红移的氨基酸，蓝色与粉色表示与有效亮度相关的氨基酸；(b)和(c)分别为BDFP1.8在M81K和A127V处的局部结构。图3BDFPs荧光蛋白与BV的体外聚合作用。溶液中BDFPsBV的荧光增强。将18μMBDFPs与0.1(a),(b)1，(c)10μMBV在KPB缓冲液(包含150mM/L氯化钠，pH值7.2)中孵化，利用F＝A1-A2exp-kt方程拟合荧光指数增长。(d)HEK293t细胞中BDFPs的有效亮度与平均k值(t50％＝ln2/k)的关系，BDFP1.7的有效亮度设为1。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种近红外光荧光蛋白，其特征在于，所述近红外光荧光蛋白包括BDFP远红光荧光蛋白的氨基酸序列，并且包括在第113位、125位和127位的氨基酸处的突变，所述BDFP远红光荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种近红外光荧光蛋白，其特征在于，所述近红外光荧光蛋白包括BDFP远红光荧光蛋白的氨基酸序列，并且包括在第113位、125位和127位的氨基酸处的突变，所述BDFP远红光荧光蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.根据权利要求1所述的近红外光荧光蛋白，其特征在于，所述近红外光荧光蛋白还包括在第30、50、54、57、76、77、80、81、94、101、108、143和/或151位的氨基酸处的突变。3.根据权利要求1或2所述的近红外光荧光蛋白，其特征在于，第113位苯丙氨酸突变为亮氨酸；第125位半胱氨酸突变为甘氨酸；第127位丙氨酸突变为苏氨酸或颉氨酸。4.根据权利要求2所述的近红外光荧光蛋白，其特征在于，第30位亮氨酸突变为苯丙氨酸；第50位谷氨酸突变为颉氨酸；第54位苏氨酸突变为丝氨酸；第57位丝氨酸突变为甘氨酸；第76位苏氨酸突变为丙氨酸；第77位精氨酸突变为组氨酸；第80位天冬酰胺突变为懒氨酸；第81...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏坤，付卫雷，佟顺刚，
申请(专利权)人：广州天宝颂原生物科技开发有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44