可转化的衔接子制造技术

本发明专利技术涉及一种方法和试剂盒，所述方法和试剂盒包含单链或至少部分双链的衔接子，所述衔接子包含具有碱基修饰的序列，所述碱基修饰与核酸片段连接并转化以生成用于特异性识别的非对称末端。该方法基于两种主要的序列转换机制，即特定碱基的直接转化和通过复制的间接转化，其中这两种机制可以组合在一起。

Transformable linker

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】可转化的衔接子本专利技术属于生物化学和诊断领域。它尤其属于分子生物学和核酸库的生成领域，更具体地涉及到用于测序的核酸库模板的生成。
技术介绍
基础研究、诊断、治疗和取证中的许多方法都基于核酸分析。最近，已经开发出高度平行的过程，例如微阵列和下一代测序(也称为“大规模平行测序”)，其允许同时分析数千、数百万甚至超过数十亿的不同核酸分子。为此，需要将核酸转化为一个通用形式，以作为核酸库而被并行处理。最佳的库形式是为未知核酸提供的常见侧翼序列，即所谓的衔接子。由于许多分析过程需要诸如PCR之类的核酸扩增步骤，因此侧翼序列代表至少两种不同特异性引物的结合位点。向未知核酸中添加衔接子的经典方法是首先生成平端的双链DNA片段。然后将这些片段与两种不同的平端双链衔接子一起培养，并用连接酶(例如T4DNA连接酶)连接。为了避免过量的衔接子二聚体，只有平端的双链DNA片段被磷酸化，并且衔接子只有一端可以连接。然而，使用平端DNA得到的连接效率低于使用粘性末端。此外，由于片段排列被连接到两个不同的衔接子，所以只有一半的连接产物在两端产生不同的衔接子。因此，在PCR中只能有效地扩增一半的连接产物。较新的方法涉及到使用具有两个不同引物结合位点的一个衔接子，所述引物结合位点连接至给定双链DNA片段的每个末端的5’和3’末端。因此，双链DNA片段的两条链中的每一条都具有不同的引物结合位点，以实现高效的PCR扩增。通过向双链DNA片段添加确定的3’单碱基突出端，并利用具有互补单碱基突出端的衔接子，使连接反应更加有效并且不产生任何二聚体或其他多聚体。目前，两种商业方法解决了这些与经典衔接子相关的问题。WO2007/052006A1中公开的一种方法基于Y形衔接子形式，该形式代表两个退火的寡核苷酸，该寡核苷酸包含可连接末端的互补双链区和未配对核苷酸(包含可用作特异性引物结合位点的不同序列)的叉状端或尾端。WO2009/133466A2中公开的另一种方法基于一种发夹形衔接子，其包含一个部分退火的寡核苷酸，该寡核苷酸含有在可连接的5’和3’末端的互补双链区域和环状连接部分，所述连接部分包含可用作特定引物结合位点的不同序列。该环包含易切割部分，其在连接后必须在另外的处理步骤中裂解，以便与下游核酸库处理步骤(例如PCR)匹配。发夹和Y衔接子形式产生位于核酸库插入物两端侧翼的共同序列，其在测序中需要更长的引物，以使测序反应仅对一个末端特异。WO2009/133466A2中公开的另一种非商业衔接子形式基于一种衔接子，该衔接子在第一引物延伸步骤后在引物结合位点下游产生不同的限制酶裂解位点。这允许在裂解后与包含不同引物结合位点的第二衔接子连接。然而，这些方法包括额外且繁琐的处理步骤，或需要长的衔接子寡核苷酸，与简单的双链衔接子相比，这些长的衔接子寡核苷酸在化学合成和连接方面效率较低。需要提供一种方法，其在PCR之前连接后不需要复杂的酶处理步骤，并且使用较短的双链衔接分子，同时没有那些不在生成的核酸库中产生共同侧翼序列的复杂结构。
技术实现思路
本专利技术解决了有关提供一种基于单个衔接分子的方法的技术问题，所述单个衔接分子无包含分叉或发夹结构的长条形寡核苷酸，被起连接作用的酶很好地接受，并且在连接后无需额外的步骤来生成在末端没有广泛的共同序列的核酸库。该技术问题的一解决方式是提供至少部分双链的衔接子，其序列在连接后转化，所述衔接子在引物结合位点区域包含一个或多个修饰碱基；所述引物结合位点连接至核酸片段的两端，并转化为至少两个不同的引物结合位点，用于与一种以上的特异性引物发生有效的扩增反应。根据本专利技术的方法的优点是使衔接子核苷酸的长度减少到引物结合位点。或者，可以使用基本上单链的衔接子，其中仅需连接一条链，这有利于与起连接作用的酶(例如拓扑异构酶和仅能连接一条链的转座酶)结合。衔接子尺寸的减小使寡核苷酸的合成更加高效和经济，并使核酸库中的共同侧翼序列最小化为可选的要素，例如条形码和酶识别位点。因此，测序引物可能不包含可以退火至模板的两端的3’末端，由此降低了对引物的5’部分具有更强大和特异性的结合能力的要求。起连接作用的酶需要确定的双链核酸用于有效的连接，这是通过省略诸如单链尾和环之类的有问题的结构来实现的。在连接后，整个库生成过程可能无需单独的和中间的酶促补齐步骤，因为通过聚合酶完成的序列转换代表强制性扩增步骤的一组成部分。本专利技术的第一方面涉及一种用于产生非对称标记核酸片段的方法，所述方法包括以下步骤：i.将衔接子连接到双链核酸片段的每个末端，其中所述衔接子包含连接位点和引物结合区；以及ii.特别是通过直接转化第一衔接子内包含的至少一个碱基，将引物结合区中的第一衔接子序列转换成引物结合位点；或者将第一衔接子序列复制到引物结合位点，其中引物结合位点与第一衔接子序列互补或相同，但至少一个位置除外；以及/或者iii.实施始于引物与引物结合位点杂交的核酸合成步骤，并生成第二引物结合位点，从而产生非对称标记核酸片段。在某些实施方式中，衔接子的引物结合区包含一个(优选两个或更多个)碱基，其在产生非对称标记核酸片段的方法的步骤ii)中直接转化为不同的编码碱基。在某些实施方式中，在用于产生非对称标记核酸片段的方法中，引物结合区中碱基的直接转化是通过酶促、化学或光化学反应进行的。在某些实施方式中，在用于产生非对称标记核酸片段的方法中，碱基的酶促直接转化是通过核酸修复酶、乙酰酯酶和/或青霉素G酰化酶进行的。在某些实施方式中，在用于产生非对称标记核酸片段的方法中，碱基的化学直接转化是通过Staudinger反应除去掩蔽基团进行的。在某些实施方式中，用于产生非对称标记核酸片段的本专利技术方法涉及到一种衔接子，该衔接子在引物结合区中含有一个或多个通用碱基和/或可转化碱基，这些碱基不是未修饰的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸苷或尿嘧啶。在另一实施方式中，用于产生非对称标记核酸片段的本专利技术方法涉及到一种衔接子，该衔接子在引物结合区中含有一个或多个通用碱基和/或可转化碱基，这些碱基不是未修饰的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸苷或尿嘧啶。在某些实施方式中，通用碱基选自肌苷(次黄嘌呤)、黄嘌呤、恶唑烷、8-氧代鸟嘌呤、尼布拉林、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、4-甲基吲哚、O4-甲基胸苷(O4mT)、O4-乙基胸苷(O4eT)、6H,8H-3,4-二氢-嘧啶并[4,5-c][1,2]恶嗪-7-酮(P)、N6-甲氧基-2,6-二氨基嘌呤(K)、5-氟吲哚碱、吡咯烷、dSpacer(1’,2’-双脱氧核糖)或无碱基位点。在另一实施方式中，用于产生非对称标记核酸片段的本专利技术方法涉及到一种衔接子，该衔接子在引物结合区中含有一个或多个通用碱基和/或可转化碱基，其中特别是衔接子内包含的一个或多个碱基(尤其是一个或多个通用碱基和/或可转化碱基)是修饰碱基。在某些实施方式中，可转化碱基包括O4-甲基胸苷、O6-甲基鸟嘌呤、S4-甲基硫代尿苷、S4-甲基硫代胸苷、S6-甲基硫代鸟嘌呤、N1-甲基腺嘌呤、N3-甲基腺嘌呤、C8-甲基鸟嘌呤、N2,3-亚乙烯基鸟嘌呤、O6-甲基次黄嘌呤、O4-乙基胸苷、O6-乙基鸟嘌呤、S4-乙基硫代尿苷、S4-乙基硫代胸苷、S6-乙基硫代鸟嘌呤、N1-乙基腺嘌呤、N3-乙基腺嘌呤、C8-乙基鸟嘌呤、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于产生非对称标记核酸片段的方法，所述方法包括以下步骤：i.将第一衔接子核酸分子连接至双链核酸片段的模板链以及将第二衔接子核酸分子连接至所述双链核酸片段的互补链；其中所述第一和所述第二衔接子核酸分子酸的特征在于具有相同的碱基序列，并且包含连接位点和引物结合区，并且所述引物结合区包含至少一个通用碱基和/或至少一个可转化碱基，并且其中可选地所述第一衔接子核酸分子和所述第二衔接子核酸分子至少部分是双链的，并且其中可选地两条链都是所述第一和所述第二衔接子核酸分子，并且与所述双链核酸片段连接；ii.可选地将包含所述第一和/或所述第二衔接子核酸分子的所述至少一个可转化碱基转化为至少一种转化碱基；iii.通过进行第一延伸步骤获得第一反义衔接子核酸分子和第二反义衔接子核酸分子，其中：‑延伸所述互补链，从而产生与所述互补链连接的所述第一反义衔接子核酸分子，并延伸所述模板链，从而产生与所述模板链连接的第二反义衔接子核酸分子；或者‑将引物退火至与所述模板链连接的所述至少部分双链的第二衔接子核酸分子的链并延伸，从而产生包含所述引物的核酸链、与所述模板链互补的核酸序列、以及所述第一反义衔接子核酸分子；以及将引物退火至与所述互补链连接的所述至少部分双链的第一衔接子核酸分子的链并延伸，从而产生包含所述引物的核酸链、与所述互补链互补的核酸序列、以及所述第二反义衔接子核酸分子；其中所述第一反义衔接子核酸分子与所述第一衔接子核酸分子基本上互补，所述第二反义衔接子核酸分子与所述第二衔接子核酸基本上互补，但在与所述第一和第二衔接子核酸分子内包含的所述至少一个通用的、可转化的或已转化的碱基相对的位置除外，从而产生非对称标记核酸片段。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.09.12 EP 16188292.31.一种用于产生非对称标记核酸片段的方法，所述方法包括以下步骤：i.将第一衔接子核酸分子连接至双链核酸片段的模板链以及将第二衔接子核酸分子连接至所述双链核酸片段的互补链；其中所述第一和所述第二衔接子核酸分子酸的特征在于具有相同的碱基序列，并且包含连接位点和引物结合区，并且所述引物结合区包含至少一个通用碱基和/或至少一个可转化碱基，并且其中可选地所述第一衔接子核酸分子和所述第二衔接子核酸分子至少部分是双链的，并且其中可选地两条链都是所述第一和所述第二衔接子核酸分子，并且与所述双链核酸片段连接；ii.可选地将包含所述第一和/或所述第二衔接子核酸分子的所述至少一个可转化碱基转化为至少一种转化碱基；iii.通过进行第一延伸步骤获得第一反义衔接子核酸分子和第二反义衔接子核酸分子，其中：-延伸所述互补链，从而产生与所述互补链连接的所述第一反义衔接子核酸分子，并延伸所述模板链，从而产生与所述模板链连接的第二反义衔接子核酸分子；或者-将引物退火至与所述模板链连接的所述至少部分双链的第二衔接子核酸分子的链并延伸，从而产生包含所述引物的核酸链、与所述模板链互补的核酸序列、以及所述第一反义衔接子核酸分子；以及将引物退火至与所述互补链连接的所述至少部分双链的第一衔接子核酸分子的链并延伸，从而产生包含所述引物的核酸链、与所述互补链互补的核酸序列、以及所述第二反义衔接子核酸分子；其中所述第一反义衔接子核酸分子与所述第一衔接子核酸分子基本上互补，所述第二反义衔接子核酸分子与所述第二衔接子核酸基本上互补，但在与所述第一和第二衔接子核酸分子内包含的所述至少一个通用的、可转化的或已转化的碱基相对的位置除外，从而产生非对称标记核酸片段。2.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个可转化碱基和所述至少一种转化碱基优选与不同碱基配对。3.如权利要求1或2所述的方法，包括以下步骤：-所述第一延伸步骤，其中延伸所述互补链，从而产生与所述互补链连接的所述第一反义衔接子核酸分子，并延伸所述模板链，从而产生与所述模板链连接的所述第二反义衔接子核酸分子；以及-第二延伸步骤，其中·将引物退火至所述第二反义核酸分子并延伸，从而产生包含所述引物的核酸链、与所述互补链互补的核酸、以及第三反义衔接子核酸分子；·将引物退火至所述第一反义衔接子核酸分子并延伸，从而产生包含所述引物的核酸链、与所述模板链互补的核酸、以及第四反义衔接子核酸分子；以及·所述第三反义衔接子核酸分子与所述第一衔接子核酸分子基本上互补，所述第二反义衔接子核酸分子与所述第二衔接子核酸基本上互补，但在与所述第一和第二衔接子核酸分子内包含的所述至少一个通用的、可转化的或已转化的碱基相对的位置除外，并且所述第三和第四反义衔接子核酸分子的特征在于具有不同的碱基序列，从而产生非对称标记核酸片段。4.如权利要求1或2所述的方法，包括以下步骤：-所述第一延伸步骤，其中·将引物退火至与所述模板链连接的所述至少部分双链的第二衔接子核酸分子的所述链并延伸，从而产生包含所述引物的所述核酸链、与所述互补链互补的所述核酸、以及所述第一反义衔接子核酸分子；以及·将引物退火至与所述互补链连接的所述至少部分双链的第...

【专利技术属性】
技术研发人员：耶恩·格洛克，马库斯·弗罗姆，
申请(专利权)人：维尔道应用技术大学，
类型：发明
国别省市：德国,DE