通过CRISPR/CPF1介导的基因编辑来预防肌营养不良制造技术

迪谢内肌营养不良(DMD)是由编码肌养蛋白(肌纤维完整性所需的蛋白质)的基因中的突变引起的遗传性X连锁疾病。本公开内容报道了CRISPR/Cpf1介导的基因编辑(Myo编辑)有效地校正mdx小鼠(DMD模型)中的肌养蛋白基因突变。此外，本公开内容报道了通过出生后递送腺相关病毒(AAV)，通过使突变体外显子的永久跳读工程化和使外显子跳读延长来优化mdx小鼠的种系编辑也校正疾病。AAV介导的Myo编辑可高效地在体内挽救mdx小鼠中肌养蛋白的阅读框。本公开内容报道了Myo编辑介导的外显子跳读的方式已经成功地从小鼠中的体细胞组织进展为人DMD患者来源的iPSC(诱导多能干细胞)。在来自具有不同突变的患者的iPSC上进行了定制Myo编辑，并且成功地恢复了针对IPSC来源的心肌细胞中所有突变的肌养蛋白蛋白质表达。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过CRISPR/CPF1介导的基因编辑来预防肌营养不良优先权请求本申请要求于2016年11月28日提交的且标题为“PreventionofMuscularDystrophybyCRISPR/Cpf1-MediatedGeneEditing”的美国临时专利申请序列号62/426,853的优先权，其公开内容在此通过引用整体并入。联邦资助支持条款本专利技术是在由国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的DK-099653和U54-HD087351的政府支持下完成的。政府对本专利技术具有某些权利。序列表本申请包含已经以ASCII格式电子提交且在此通过引用整体并入的序列表。2017年11月28日创建的所述ASCII拷贝名称为UTFD_3124WO.txt且大小为189,059字节。
本公开内容涉及分子生物学、医学和遗传学的领域。更具体地，本公开内容涉及使用基因组编辑来治疗迪谢内肌营养不良(Duchennemusculardystrophy，DMD)。
技术介绍
迪谢内肌营养不良(DMD)是由编码肌养蛋白(dystrophin)(其是肌细胞膜完整性所必需的大细胞骨架蛋白质)的基因中的突变引起的X连锁隐性疾病。DMD导致进行性肌无力(muscleweakness)，最终导致30岁时过早死亡，通常由于心肌病。对于这种疾病没有有效的治疗。已经尝试了许多挽救DMD中肌养蛋白表达的方法，包括通过重组体腺相关病毒(recombinantadeno-associatedvirus，rAAV)递送截短的肌养蛋白或肌营养相关蛋白(utrophin)，以及用反义寡核苷酸和小分子跳读突变体外显子。然而，这些方法不能校正DMD突变或永久地恢复肌养蛋白表达。因此，本领域中需要用于治疗DMD的组合物和方法，其校正DMD突变以解决疾病的潜在原因，从而永久地恢复肌养蛋白表达。
技术实现思路
本公开内容提供了组合物，其包含编码Cpf1多肽的序列和编码DMD指导RNA(gRNA)的序列，其中DMDgRNA靶向肌养蛋白剪接位点，并且其中DMDgRNA包含SEQIDNo.448至770中的任一个。在一些实施方案中，编码Cpf1多肽的序列分离自或来源于编码毛螺菌科(Lachnospiraceae)Cpf1多肽的序列。在一些实施方案中，编码Cpf1多肽的序列分离自或来源于编码氨基酸球菌属(Acidaminococcus)Cpf1多肽的序列。在一些实施方案中，编码Cpf1多肽的序列或编码DMDgRNA的序列包含RNA序列。在一些实施方案中，RNA序列是mRNA序列。在一些实施方案中，RNA序列包含至少一个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，编码Cpf1多肽的序列包含DNA序列。在一些实施方案中，第一载体包含编码Cpf1多肽的序列，并且第二载体包含编码DMDgRNA的序列。在一些实施方案中，第一载体或编码Cpf1多肽的序列还包含第一polyA序列。在一些实施方案中，第二载体或编码DMDgRNA的序列还包含第二polyA序列。在一些实施方案中，第一载体或第二载体还包含编码可检测标记的序列。在一些实施方案中，可检测标记是荧光标记。在一些实施方案中，第一载体或编码Cpf1多肽的序列还包含第一启动子序列。在一些实施方案中，第二载体或编码DMDgRNA的序列还包含第二启动子序列。在一些实施方案中，所述启动子第一启动子序列和第二启动子序列是相同的。在一些实施方案中，第一启动子序列和第二启动子序列是不相同的。在一些实施方案中，第一启动子序列或第二启动子序列包含组成型启动子。在一些实施方案中，第一启动子序列或第二启动子序列包含诱导型启动子。在一些实施方案中，第一启动子序列或第二启动子序列包含肌细胞特异性启动子。在一些实施方案中，肌细胞特异性启动子是肌球蛋白轻链-2启动子、α-肌动蛋白启动子、肌钙蛋白1启动子、Na+/Ca2+交换体(exchanger)启动子、肌养蛋白启动子、α7整联蛋白启动子、脑钠肽启动子、αB-晶体蛋白/小热休克蛋白启动子、α-肌球蛋白重链启动子或ANF启动子。在一些实施方案中，第一载体或第二载体还包含编码2A样自切割结构域的序列。在一些实施方案中，编码2A样自切割结构域的序列包含TaV-2A肽。在一些实施方案中，载体包含编码Cpf1多肽的序列和编码DMDgRNA的序列。在一些实施方案中，载体还包含polyA序列。在一些实施方案中，载体还包含启动子序列。在一些实施方案中，启动子序列包含组成型启动子。在另一些实施方案中，启动子序列包含诱导型启动子。在一些实施方案中，启动子序列包含肌细胞特异性启动子。在一些实施方案中，肌细胞特异性启动子是肌球蛋白轻链-2启动子、α-肌动蛋白启动子、肌钙蛋白1启动子、Na+/Ca2+交换体启动子、肌养蛋白启动子、α7整联蛋白启动子、脑钠肽启动子、αB-晶体蛋白/小热休克蛋白启动子、α-肌球蛋白重链启动子或ANF启动子。在一些实施方案中，组合物包含经密码子优化以在哺乳动物细胞中表达的序列。在另一些实施方案中，组合物包含经密码子优化以在人细胞中表达的序列。在一些实施方案中，编码Cpf1多肽的序列经密码子优化以在人细胞中表达。在一些实施方案中，剪接位点是剪接供体位点。在一些实施方案中，剪接位点是剪接接纳体(spliceacceptor)位点。在另一些实施方案中，第一载体或第二载体是非病毒载体。在一些实施方案中，非病毒载体是质粒。在一些实施方案中，脂质体或纳米粒包含第一载体或第二载体。在一些实施方案中，第一载体或第二载体是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是腺相关病毒(adeno-associatedviral，AAV)载体。在一些实施方案中，AAV载体是复制缺陷型(replication-defector)或条件性复制缺陷型的(conditionallyreplicationdefective)。在一些实施方案中，AAV载体是重组体AAV载体。在一些实施方案中，AAV载体包含分离自或来源于血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或其任意组合的AAV载体的序列。在一些实施方案中，组合物还包含单链DMD寡核苷酸。在一些实施方案中，组合物还包含可药用载体。还提供了包含本公开内容的组合物的细胞。在一些实施方案中，细胞是肌细胞、卫星细胞或其前体。在一些实施方案中，细胞是iPSC或iCM。还提供了包含本公开内容的细胞的组合物。还提供了校正肌养蛋白基因缺陷的方法，其包括在适于表达Cpf1多肽和gRNA的条件下使本公开内容的细胞与组合物接触，其中所述Cpf1多肽破坏肌养蛋白剪接位点；并且其中剪接位点的破坏导致突变体DMD外显子的选择性跳读。在一些实施方案中，突变体DMD外显子是外显子23。在一些实施方案中，突变体DMD外显子是外显子51。在一些实施方案中，细胞是体内、离体、体外或原位的。本公开内容还提供了在有此需要的对象中治疗肌营养不良的方法，其包括向对象施用治疗有效量的根据本公开内容的组合物。在一些实施方案中，组合物局部施用。在一些实施方案中，组合物直接施用于肌组织。在一些实施方案中，组合物通过肌内输注或注射施用。在一些实施方案中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.组合物，其包含编码Cpf1多肽的序列和编码DMD指导RNA(gRNA)的序列，其中所述DMD gRNA靶向肌养蛋白剪接位点，并且其中所述DMD gRNA包含SEQ ID No.448至770中的任一个。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.11.28 US 62/426,8531.组合物，其包含编码Cpf1多肽的序列和编码DMD指导RNA(gRNA)的序列，其中所述DMDgRNA靶向肌养蛋白剪接位点，并且其中所述DMDgRNA包含SEQIDNo.448至770中的任一个。2.权利要求1所述的组合物，其中所述编码Cpf1多肽的序列分离自或来源于编码毛螺菌科(Lachnospiraceae)Cpf1多肽的序列。3.权利要求1所述的组合物，其中所述编码Cpf1多肽的序列分离自或来源于编码氨基酸球菌属(Acidaminococcus)Cpf1多肽的序列。4.权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述编码Cpf1多肽的序列或所述编码DMDgRNA的序列包含RNA序列。5.权利要求4所述的组合物，其中所述RNA序列是mRNA序列。6.权利要求4或5所述的组合物，其中所述RNA序列包含至少一个经化学修饰的核苷酸。7.权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述编码Cpf1多肽的序列包含DNA序列。8.权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中第一载体包含所述编码Cpf1多肽的序列，并且第二载体包含所述编码DMDgRNA的序列。9.权利要求8所述的组合物，其中所述第一载体或所述编码Cpf1多肽的序列还包含第一polyA序列。10.权利要求8所述的组合物，其中所述第二载体或所述编码DMDgRNA的序列还包含第二polyA序列。11.权利要求8至10中任一项所述的组合物，其中所述第一载体或所述编码Cpf1多肽的序列还包含第一启动子序列。12.权利要求8至10中任一项所述的组合物，其中所述第二载体或所述编码DMDgRNA的序列还包含第二启动子序列。13.权利要求11或12所述的组合物，其中所述第一启动子序列和所述第二启动子序列是相同的。14.权利要求11或12所述的组合物，其中所述第一启动子序列和所述第二启动子序列是不相同的。15.权利要求11至14中任一项所述的组合物，其中所述第一启动子序列或所述第二启动子序列包含组成型启动子。16.权利要求11至14中任一项所述的组合物，其中所述第一启动子序列或所述第二启动子序列包含诱导型启动子。17.权利要求11至16中任一项所述的组合物，其中所述第一启动子序列或所述第二启动子序列包含肌细胞特异性启动子。18.权利要求17所述的组合物，其中所述肌细胞特异性启动子是肌球蛋白轻链-2启动子、α-肌动蛋白启动子、肌钙蛋白1启动子、Na+/Ca2+交换体启动子、肌养蛋白启动子、α7整联蛋白启动子、脑钠肽启动子、αB-晶体蛋白/小热休克蛋白启动子、α-肌球蛋白重链启动子或ANF启动子。19.权利要求17所述的组合物，其中所述肌细胞特异性启动子是肌养蛋白启动子。20.权利要求17所述的组合物，其中所述肌细胞特异性启动子是α-肌球蛋白重链启动子。21.权利要求8至20中任一项所述的组合物，其中所述第一载体或所述第二载体还包含编码可检测标记的序列。22.权利要求21所述的组合物，其中所述可检测标记是荧光标记。23.权利要求8至22中任一项所述的组合物，其中所述第一载体或所述第二载体还包含编码2A样自切割结构域的序列。24.权利要求23所述的组合物，其中所述编码2A样自切割结构域的序列包含TaV-2A肽。25.权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中载体包含所述编码Cpf1多肽的序列和所述编码DMDgRNA的序列。26.权利要求25所述的组合物，其中所述载体还包含polyA序列。27.权利要求25或26所述的组合物，其中所述载体还包含启动子序列。28.权利要求27所述的组合物，其中所述启动子序列包含组成型启动子。29.权利要求27所述的组合物，其中所述启动子序列包含诱导型启动子。30.权利要求28或29所述的组合物，其中所述启动子序列包含肌细胞特异性启动子。31.权利要求30所述的组合物，其中所述肌细胞特异性启动子是肌球蛋白轻链-2启动子、α-肌动蛋白启动子、肌钙蛋白1启动子、Na+/Ca2+交换体启动子、肌养蛋白启动子、α7整联蛋白启动子、脑钠肽启动子、αB-晶体蛋白/小热休克蛋白启动子、α-肌球蛋白重链启动子或ANF启动子。32.权利要求30所述的组合物，其中所述肌细胞特异性启动子是肌养蛋白启动子。33.权利要求30所述的组合物，其中所述肌细胞特异性启动子是α-肌球蛋白重链启动子。34.权利要求25至33中任一项所述的组合物，其中所述第一载体或所述第二载体还包含编码可检测标记的序列。35.权利要求34所述的组合物，其中所述可检测标记是荧光标记。36.权利要求25至35中任一项所述的组合物，其中所述第一载体或所述第二载体还包含编码2A样自切割结构域的序列。37.权利要求36所述的组合物，其中所述编码2A样自切割结构域的序列包含TaV-2A肽。38.权利要求1至37中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含经密码子优化以在哺乳动物细胞中表达的序列。39.权利要求1至38中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含经密码子优化以在人细胞中表达的序列。40.权利要求39所述的组合物，其中所述编码Cpf1多肽的序列经密码子优化以在人细胞中表达。41.权利要求1至40中任一项所述的组合物，其中所述剪接位点是剪接供体位点。42.权利要求1至40中任一项所述的组合物，其中所述剪接位点是剪接接纳体位点。43.权利要求8至24中任一项所述的组合物，其中所述第一载体或所述第二载体是非病毒载体。44.权利要求43所述的组合物，其中所述非病毒载体是质粒。45.权利要求43或44所述的组合物，其中脂质体或纳米粒包含所述第一载体或所述第二载体。46.权利要求25至37中任一项所述的组合物，其中所述载体是非病毒载体。47.权利要求46所述的组合物，其中所述非病毒载体是质粒。48.权利要求46或47所述的组合物，其中脂质体或纳米粒包含所述载体。49.权利要求8至24中任一项所述的组合物，其中所述第一载体或所述第二载体是病毒载体。50.权利要求25至37中任一项所述的组合物，其中所述载体是病毒载体。51.权利要求49或50所述的组合物，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。52.权利要求51所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宇，龙城祖，罗达·巴塞尔达比，埃里克·奥尔松，
申请(专利权)人：得克萨斯州大学系统董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US