捕获包含靶寡核苷酸序列的核酸的方法及其用途技术

本发明专利技术提供了从核酸库捕获包含靶寡核苷酸序列的核酸的方法，包括：使核酸库与探针接触，所述核酸库包括一个包含靶寡核苷酸序列的核酸，所述探针包含与靶寡核苷酸序列互补的序列，其中所述接触可在基于四甲基氯化铵(TMAC)的缓冲液中，在约60℃至约70℃的温度下进行，所述接触可使靶寡核苷酸序列和与靶寡核苷酸序列互补的序列杂交，从而产生杂交产品；将杂交产物与库中不包含靶寡核苷酸序列的核酸分离。本发明专利技术还提供了用于实施上述方法的组合物。

Method and application of capturing nucleic acid containing target oligonucleotide sequence

【技术实现步骤摘要】
捕获包含靶寡核苷酸序列的核酸的方法及其用途
本专利技术涉及寡核苷酸杂交和核酸纯化领域，特别是涉及一种从核酸库中捕获包含靶寡核苷酸序列的核酸的方法及其用途。
技术介绍
新一代测序可使无数基因组在一段时间内进行测序。尽管现有技术先进，但全基因组测序仍非常昂贵，因此需要靶富集。有两种类型的靶富集策略：基于扩增子和基于杂交。扩增子策略依赖于使用称为引物的短互补核苷酸序列，通过基于聚合酶链反应(PCR)的靶扩增来进行富集。但这会导致DNA片段的缺失，从而导致变体缺失，发生错误。另一方面，杂交策略依赖于基于互补性的DNA结合片段，从而可针对给定靶标，有效地捕获所有变体。但杂交策略存在链偏差、不均匀覆盖，以及低效结合和捕获等问题。
技术实现思路
在本专利技术提供的方法中使用新的基于四甲基氯化铵(TMAC)的缓冲液，可提供比本领域已知的其他方法较低的脱靶率和较均匀的靶标覆盖率。鉴于此，本专利技术提供一种从核酸库捕获包含靶寡核苷酸序列的核酸的方法，包括：使核酸库与探针接触，所述核酸库包括一个包含靶寡核苷酸序列的核酸，所述探针包含与靶寡核苷酸序列互补的序列，其中所述接触在基于TMAC的缓冲液中，在约60℃至约70℃的温度下进行，所述接触使靶寡核苷酸序列和与靶寡核苷酸序列互补的序列杂交，从而产生杂交产品；将杂交产物与库中不包含靶寡核苷酸序列的核酸分离。在一些实施例中，所述接触步骤在约64℃至约66℃的温度下进行。在一些实施例中，所述杂交产物是RNA-DNA产物。在一些实施例中，所述基于TMAC的缓冲液包含约0.5M至约4.0M的TMAC。在本说明书所述任何方法的一些实施例中，基于TMAC的缓冲液还包含以下一种或多种：约10mM至约200mM的2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇(Tris)；约1X到约5X的Denhardt’s溶液；约0.01％至约0.2％的吐温20(Tween-20)；约0.5mM至约10mM的乙二胺四乙酸(EDTA)；约0.5％至约25％(v/v)的甲酰胺。在本说明书所述任何方法的一些实施例中，基于TMAC的缓冲液还包含：约10mM至约200mM的2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇(Tris)；约1X到约5X的Denhardt’s溶液；约0.01％至约0.2％的吐温20；约0.5mM至约10mM的乙二胺四乙酸(EDTA)；约0.5％至约25％(v/v)的甲酰胺。在一些实施例中，基于TMAC的缓冲液包含：约40mM至约60mM的2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇(Tris)；约2X至约3X的Denhardt’s溶液；约0.01％至约0.05％吐温20；约0.5mM至约7mM乙二胺四乙酸(EDTA)；约0.5％至约25％(v/v)的甲酰胺。在本说明书所述任何方法的一些实施例中，基于TMAC的缓冲液包含约2.7M的TMAC、约50mM的Tris(pH8.0)、约2.5X的Denhardt’s溶液、约0.010％的吐温20、约6mM的EDTA，和约20％的甲酰胺。在本说明书所述任何方法的一些实施例中，基于TMAC的缓冲液包括约5.4M的TMAC、约100mM的Tris(pH8.0)、约5X的Denhardt’s溶液、约0.02％的吐温20和约12mM的EDTA。在本说明书所述任何方法的一些实施例中，所述接触步骤进行约1小时至约48小时。在一些实施例中，所述接触步骤进行约10小时至约20小时。在本说明书所述任何方法的一些实施例中，探针包含位于探针核酸序列内部或5'或3'末端的标签。在一些实施例中，标签是生物素或其变体。在本说明书所述任何方法的一些实施例中，使用珠进行分离。在一些实施例中，使用具有可特异性结合标签的连结部分的珠进行分离。在本说明书所述任何方法的一些实施例中，所述方法还包括接触步骤和分离步骤之后的至少一个清洗步骤。在一些实施例中，所述至少一个清洗步骤包括使用低严格性缓冲液和高严格性缓冲液。在一些实施例中，所述至少一个清洗步骤包括使用低严格性缓冲液，在约16℃至约30℃的温度下清洗约1分钟至约10小时。在本说明书所述任何方法的一些实施例中，使用低严格性缓冲液，在约23℃至约27℃的温度下清洗约5分钟至约40分钟。在一些实施例中，低严格性缓冲液包含缓冲溶液和任选的去污剂。在一些实施例中，低严格性缓冲液包含盐水-柠檬酸钠(SSC)缓冲液和任选的十二烷基硫酸钠(SDS)。在一些实施例中，低严格性缓冲液包含约0.5X至约2.5X的SSC和0％至约0.15％的SDS。在本说明书所述任何方法的一些实施例中，所述至少一个清洗步骤包括使用高严格性缓冲液，在约45℃至约75℃的温度下清洗约1分钟至约10小时。在一些实施例中，使用高严格性缓冲液，在约45℃至约75℃的温度下清洗约1分钟至约4小时。在一些实施例中，高严格性缓冲液包含约0.1X至约0.5X的SSC，和任选的清洗剂。在一些实施例中，高严格性缓冲液包含约0.15X至约0.35X的SSC，和任选的清洗剂。在一些实施例中，高严格性缓冲液包含约0％至约0.15％的SDS。本说明书还提供了包含液体的组合物，其中液体包含约0.5M至约8.0M的TMAC、约10mM至约200mM的Tris(pH8.0)、约1X至约5X的Denhardt’s溶液、约0.01％至约0.2％的吐温20、约0.5mM至约15mM的EDTA和约0.5％至约25％的甲酰胺(v/v)。在本说明书所述任何组合物的一些实施例中，液体包含约2.0M至约6.0M的TMAC。在本文所述任何组合物的一些实施例中，液体包含约5.0M至约6.0M的TMAC。在本说明书所述任何组合物的一些实施例中，液体包含约5.4M的TMAC。在本说明书所述任何组合物的一些实施例中，液体包含约40mM至约60mM的Tris(pH8.0)。在本文所述任何组合物的一些实施例中，液体包含约100mM的Tris(pH8.0)。在本说明书所述任何组合物的一些实施例中，液体包含约2X至约3X的Denhardt’s溶液。在本文所述任何组合物的一些实施例中，液体包含约5X的Denhardt’s溶液。在本说明书所述任何组合物的一些实施例中，液体包含约0.01％至约0.05％的吐温20。在本文所述任何组合物的一些实施例中，液体包含约5mM至约15mM的EDTA。在本说明书所述任何组合物的一些实施例中，液体包含约10％至约25％的甲酰胺(v/v)。在本文所述任何组合物的一些实施例中，液体包含约20％的甲酰胺(v/v)。在本说明书所述任何组合物的一些实施例中，液体包括约2.7M的TMAC、约50mM的Tris(pH8.0)、约2.5X的Denhardt’s溶液、约0.010％的吐温20、约6mM的EDTA和约20％的甲酰胺。在本说明书所述任何组合物的一些实施例中，组合物由液体组成。本专利技术还提供了包含本说明书所述任何一种组合物的试剂盒。本说明书所述的任何试剂盒的一些实施例还包括进行本说明书所述任何方法的说明书。如本说明书所用，术语“脱靶”是指富集不预计进行富集的核酸(例如，不包括靶序列的核酸)。这种“脱靶”结合可能因具有缺失区域而降低灵敏度，由于覆盖率较低而增加假阳性，导致可信度差和/或成本提高。在一些实施例中，脱靶结合会有毒性作用。如本说明书本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含液体的组合物，其特征在于，所述液体包含：0.5M至8.0M的氯化四甲铵(TMAC)；10mM至200mM的2‑氨基‑2‑(羟甲基)丙烷‑1,3‑二醇(Tris,pH8.0)；1X至5X邓哈特溶液(Denhardt’s solution)；0.01％至0.2％吐温20(Tween‑20)；0.5mM至15mM的亚乙二胺四乙酸(EDTA)；0.5％至25％甲酰胺(v/v)。

【技术特征摘要】
2018.04.12 US 15/952,0451.一种包含液体的组合物，其特征在于，所述液体包含：0.5M至8.0M的氯化四甲铵(TMAC)；10mM至200mM的2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇(Tris,pH8.0)；1X至5X邓哈特溶液(Denhardt’ssolution)；0.01％至0.2％吐温20(Tween-20)；0.5mM至15mM的亚乙二胺四乙酸(EDTA)；0.5％至25％甲酰胺(v/v)。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述液体包含2.0M至6.0M的TMAC。3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述液体包含5.0M至6.0M的TMAC。4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述液体包含5.4M的TMAC。5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述液体包含40mM至60mM的Tris(pH8.0)。6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅蕊，卢卡斯朱利安，古帕塔普莱尤斯，
申请(专利权)人：合度精密生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：开曼群岛,KY