用于HIV疫苗接种的免疫原制造技术

本申请涉及用于HIV疫苗接种的免疫原。本发明专利技术涉及基于重叠肽(OLP)及由其衍生的肽的新免疫原，其可用于预防和治疗AIDS及其相关的机会性疾病。本发明专利技术还涉及表达这些免疫原的分离的核酸、载体和宿主细胞以及包含所述免疫原的疫苗。

【技术实现步骤摘要】
用于HIV疫苗接种的免疫原本申请是申请日为2013年1月28日、申请号为“201380006995.6”、专利技术名称为“用于HIV疫苗接种的免疫原”的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/EP2013/051596的中国国家阶段申请。
本专利技术涉及基于重叠肽(overlappingpeptide，OLP)及由其衍生的肽的新免疫原。其还涉及表达这些免疫原的分离的核酸以及包含这样的核酸的载体和细胞。本专利技术的化合物可用作疫苗，特别地用于预防和治疗AIDS和机会性疾病(opportunisticdisease)。
技术介绍
HIV感染诱导强的并且广泛指向的I类HLA限制性T细胞应答，对于所述应答，特异性表位和限制性HLA等位基因参与相关的体内控制。参见BranderC等，CurrentOpinionImmunol.2006；18：1-8。尽管大部分抗病毒CTL应答表现为受限于HLA-B的，但是依然不清楚靶病毒区域和限制性HLA分子对于这些应答的效果的相对贡献。参见KiepielaP等，Nature2004；432：769-775和NgumbelaK等，AIDSRes.Hum.Retroviruses2008；24：72-82。此外，不清楚HIV序列多样性在病毒特异性T细胞免疫的体内相关性中的作用，这是因为逃逸变体(escapevariant)的功能约束、个别蛋白质位置处的密码子使用、T细胞受体(TCR)可塑性和功能亲和力以及交叉反应潜力都可能有助于特异性T细胞应答的整体效果。参见BrockmanM等，J.Virol.2007；81：12608-12618和YerlyD等，J.Virol.2008；82：3147-3153。值得注意的是，对HIVGag的T细胞应答最一贯地与HIV分化体B和分化体C感染群二者中降低的病毒载量有关。参见R等，J.Virol.2006；80：3122-3125和KiepielaP等，Nat.Med.2007；13：46-53。但是，这些分析都未对针对可诱导特别有效的应答的靶蛋白的较短区域的应答的作用进行评估。此外，尚不清楚Gag的相对益处是否是由于该蛋白质的其他特性，例如表达水平、氨基酸组成和固有的较强免疫原性。因此，可行的是，Gag外部的蛋白质亚基和这些亚基中特定的短表位富集区域可被认为：i)诱导在HIV控制者中主要可见的应答和ii)其可在多种HLA类型中的个体中检测，而不限于表达了先前与有效病毒控制有关的等位基因的个体。尽管一些早期研究的确控制了呈现在“良好”I类HLA等位基因上的Gag衍生表位的潜在的过表达，但是关注点依然在于纯粹的基于Gag的HIV疫苗可能主要使具有有利的HLA基因型的那些人受益，而不能利用Gag外部的潜在有益的靶标。参见Kiepiela，2007，同上和HoneyborneI等，J.Virol.2007；81：3667-3672。此外，CTL逃逸和病毒适合度研究极大地局限于在相关保护性HLA等位基因如HLA-B57和HLA-B27的背景下存在的Gag衍生表位。参见SchneidewindA等，J.Virol.2007；81：12382-12393和LeslieA等，Nat.Med.2004；10：282-289。因此，可利用信息可能未提供用于被设计为保护遗传多样的大部分的人宿主群的免疫原序列相关信息。此外，许多研究仅集中于免疫优势靶标，但是一些在HIV和SIV感染方面最近研究证明了次优势应答在体内病毒控制中的关键贡献，其中靶标位于Gag外部。参见FrahmN等，Nat.Immunol.2006；7：173-178和FriedrichT等，J.Virol.2007；81：3465-3476。总之，因此对于可构成对HIV的保护性细胞免疫应答的目前的观点可能相当偏颇地集中于免疫优势应答和受频繁的I类HLA等位基因和与较好的疾病结果有关的HLA等位基因限制的应答。因此，HIV疫苗的开发部分地受限于能够诱导广泛的免疫应答的免疫原的缺乏。本专利技术满足了这样的免疫原的设计。
技术实现思路
在第一个方面，本专利技术涉及免疫原性多肽，其具有包含序列SEQIDNO1至16或所述SEQIDNO：1至16的变体的氨基酸序列，其中每一个所述变体均具有至少8个氨基酸的长度，前提条件是所述氨基酸序列不包含除了根据SEQIDNO1至16或其变体中的任一者的氨基酸序列之外的来源于HIV基因组的8个或更多个氨基酸长度的任何序列片段。在第二个方面，本专利技术涉及免疫原性多肽，其具有包含选自SEQIDNO1至16或其变体的至少一个序列的氨基酸序列，其中所述变体具有至少8个氨基酸的长度，前提条件是：i)所述免疫原氨基酸序列不包含除了根据SEQIDNO1至16或者其变体或片段中的任一者的氨基酸序列之外的来源于HIV基因组的8个或更多个氨基酸长度的任何序列片段，并且ii)当所述免疫原仅包含一个选自SEQIDNO1至16的序列时，则该序列不选自SEQIDNO：3、5、6和16。在另一个方面，本专利技术涉及编码第一个方面和第二个方面的免疫原的核酸，以及包含所述核酸的表达盒、载体、病毒和细胞。在另一个方面，本专利技术涉及疫苗，其包含根据实施方案1至11中任一项所述的免疫原性多肽和一种或更多种佐剂。在另一个方面，本专利技术涉及免疫原性多肽，第三个方面的核酸、表达盒、表达载体、病毒或细胞，或者组合物疫苗，其用于医学。在另一个方面，本专利技术涉及免疫原性多肽，第三个方面的核酸、表达盒、表达载体、病毒或细胞，或者组合物疫苗，其用于预防或治疗HIV感染或与HIV感染相关的疾病。在另一个方面，本专利技术涉及试剂盒，其包含第一和/或第二个方面的免疫原，第三个方面的核酸、表达盒、表达载体、病毒或细胞，或者第四个方面的组合物。微生物保藏质粒298HGMCSF-HIVACATDNA于2012年1月13日以登记号DSM25555保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ-DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen，Inhoffenstraβe7B，D-38124Braunschweig，FederalRepublicofGermany)。附图说明图1.表达质粒中包含的基因的示意图。点指示起始密码子和终止密码子。图2.通过流式细胞分析术在合并脾细胞中分析的细胞免疫应答。在(a)中示出了组间总Gag、Pol和Nef-Tat-Vif特异性干扰素γ应答的频率以及在(b)中示出了CD4和CD8应答的分布。图3.通过干扰素γELISpot测定在小鼠脾细胞中测量的对Gag、Pol、NTV和HIVACATT细胞免疫原序列的应答。利用编码全Gag、Pol和Nef-Tat-Vif多肽的质粒对个体小鼠进行免疫接种。示出了靶向HIVACATT细胞免疫原中包含的区域的应答对总干扰素γGag-Pol-NTV特异性应答的贡献。图4.免疫小鼠中靶向HIVACATT细胞免疫原的干扰素γ应答的宽度(a)和量级(b)的比较。利用编码全蛋白质或最小T细胞序列的质粒处理对象。图5.利用20μg编码全Gag、Pol加上Nef-Tat-Vif多肽的质粒和HIVACATT细胞免疫原对小鼠进行免疫接种，应答针对Gag、Pol、Vif或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免疫原性融合蛋白，其包含：i)多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21；ii)多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：2；iii)多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：3；iv)多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27；v)多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：5；vi)多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6；vii)多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；viii)多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33；ix)多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：9；x)多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37；xi)多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39；xii)多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41；xiii)多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：13；xiv)多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：14；xv)多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：15；以及xvi)多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：16；其中所述多肽中的至少两个通过氨基酸接头连接，并且每个多肽的氨基酸序列的长度为11‑85个氨基酸。...

【技术特征摘要】
2012.01.27 EP 12382031.81.一种免疫原性融合蛋白，其包含：i)多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQIDNO：17、SEQIDNO：18、SEQIDNO：19、SEQIDNO：20和SEQIDNO：21；ii)多肽，其包含氨基酸序列SEQIDNO：2；iii)多肽，其包含氨基酸序列SEQIDNO：3；iv)多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQIDNO：24、SEQIDNO：25、SEQIDNO：26和SEQIDNO：27；v)多肽，其包含氨基酸序列SEQIDNO：5；vi)多肽，其包含氨基酸序列SEQIDNO：6；vii)多肽，其包含氨基酸序列SEQIDNO：7；viii)多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQIDNO：31、SEQIDNO：32和SEQIDNO：33；ix)多肽，其包含氨基酸序列SEQIDNO：9；x)多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQIDNO：35、SEQIDNO：36和SEQIDNO：37；xi)多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQIDNO：38和SEQIDNO：39；xii)多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQIDNO：40和SEQIDNO：41；xiii)多肽，其包含氨基酸序列SEQIDNO：13；xiv)多肽，其包含氨基酸序列SEQIDNO：14；xv)多肽，其包含氨基酸序列SEQIDNO：15；以及xvi)多肽，其包含氨基酸序列SEQIDNO：16；其中所述多肽中的至少两个通过氨基酸接头连接，并且每个多肽的氨基酸序列的长度为11-85个氨基酸。2.根据权利要求1所述的免疫原性融合蛋白，其中多肽i)包含氨基酸序列SEQIDNO：17、SEQIDNO：19和SEQIDNO：21。3.根据权利要求1所述的免疫原性融合蛋白，其中多肽i)包含氨基酸序列SEQIDNO：17和SEQIDNO：19。4.根据权利要求1所述的免疫原性融合蛋白，其中多肽i)包含氨基酸序列SEQIDNO：17和SEQIDNO：20。5.根据权利要求1所述的免疫原性融合蛋白，其中多肽i)包含氨基酸序列SEQIDNO：17和SEQIDNO：21。6.根据权利要求1所述的免疫原性融合蛋白，其中多肽i)包含氨基酸序列SEQIDNO：18和SEQIDNO：20。7.根据权利要求1所述的免疫原性融合蛋白，其中多肽i)包含氨基酸序列SEQIDNO：18和SEQIDNO：21。8.根据权利要求1至7中任一项所述的免疫原性融合蛋白，其中多肽iv)包含氨基酸序列SEQIDNO：24和SEQIDNO：26。9.根据权利要求1至7中任一项所述的免疫原性融合蛋白，其中多肽iv)包含氨基酸序列SEQIDNO：25和SEQIDNO：27。10.根据权利要求1至9中任一项所述的免疫原性融合蛋白，其中多肽viii)包含氨基酸序列SEQIDNO：31和SEQIDNO：33。11.根据权利要求1至9中任一项所述的免疫原性融合蛋白，其中多肽x)包含氨基酸序列SEQIDNO：35和SEQIDNO：37。12.根据权利要求1至11中任一项所述的免疫原性融合蛋白，其中多肽i)-xvi)中的至少两个通过一个、两个或三个丙氨酸接头连接，其中所述接头导致在相邻序列之间的连接区中形成AAA序列区。13.根据权利要求1至12中任一项所述的免疫原性融合蛋白，其中所述免疫原性融合蛋白的氨基酸序列包含至少一个抗逆转录病毒抗性突变位点。14.一种核酸，其编码权利要求1至13中任一项所述的免疫原性融合蛋白。15.根据权利要求14所述的核酸，其已经进行了密码子优化以在人细胞中表达。16.一种病毒，其包含权利要求14或15所述的核酸。17.根据权利要求16所述的病毒，其中所述病毒是经修饰的安卡拉痘苗病毒。18.一种细胞，其包含权利要求14或15所述的核酸或者权利要求16或17所述的病毒。19.一种疫苗，其包含根据权利要求1至13中任一项所述的免疫原性融合蛋白和一种或更多种佐剂。20.权利要求1至13中任一项所述的免疫原性融合蛋白、权利要求14或15所述的核酸、权利要求16或17所述的病毒、权利要求18所述的细胞或权利要求19所述的疫苗，其用于医学。21.权利要求1至13中任一项所述的免疫原性融合蛋白、权利要求14或15所述的核酸、权利要求16或17所述的病毒、权利要求18所述的细胞或权利要求19所述的疫苗，其用于预防或治疗HIV感染或与HIV感染相关的疾病。22.一种试剂盒，其包含权利要求1至13中任一项所述的免疫原性融合蛋白、权利要求14或15所述的核酸、权利要求16或17所述的病毒、权利要求18所述的细胞或权利要求19所述的疫苗。23.一种免疫原性组合物，其包含可溶性多肽，其中所述可溶性多肽包含氨基酸序列SEQIDNO：17-45，并且其中每个可溶性多肽的氨基酸序列的长度为11-27个氨基酸。24.根据权利要求23所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包含一种或更多种佐剂。25.根据权利要求23或24所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包含一种或更多种热休克蛋白。26.根据权利要求25所述的免疫原性组合物，其中所述可溶性多肽中的一个或更多个与所述热休克蛋白融合。27.根据权利要求25或26所述的免疫原性组合物，其中所述热休克蛋白选自：Hsp10、Hsp20、Hsp30、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp90、gp96和Hsp100。28.根据权利要求23至27中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物被制备为可注射液体溶液、悬液或乳液。29.根据权利要求23至28中任一项所述的免疫原性组合物，其用于医学。30.根据权利要求23至28中任一项所述的免疫原性组合物，其用于预防或治疗HIV感染或与HIV感染相关的疾病。31.一种免疫原性融合多肽，其包含第一多肽片段和第二多肽片段，其中所述第一多肽片段包含与氨基酸序列SEQIDNO：1具有至少70％一致性的氨基酸序列，其中所述第二多肽片段包含与氨基酸序列SEQIDNO：2-16中的任一个具有至少90％一致性的氨基酸序列，并且其中所述第一多肽片段与所述第二多肽片段通过氨基酸接头邻接。32.根据权利要求31所述的免疫原性融合多肽，其中所述第一多肽片段包含与氨基酸序列SEQIDNO：1具有至少95％一致性的氨基酸序列。33.根据权利要求32所述的免疫原性融合多肽，其中所述第一多肽片段包含与氨基酸序列SEQIDNO：1具有至少99％一致性的氨基酸序列。34.根据权利要求33所述的免疫原性融合多肽，其中所述第一多肽片段包含氨基酸序列SEQIDNO：1。35.根据权利要求31至34中任一项所述的免疫原性融合多肽，其中所述第二多肽片段包含与氨基酸序列SEQIDNO：2至少90％、至少95％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。36.根据权利要求31至34中任一项所述的免疫原性融合多肽，其中所述第二多肽片段包含与氨基酸序列SEQIDNO：...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯蒂安·布兰德，比阿特丽斯·莫特普哈达斯，阿努什卡·拉诺，
申请(专利权)人：埃斯蒂维制药有限公司，私人艾滋病研究基金会银行，
类型：发明
国别省市：西班牙,ES