恩夫韦肽的制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及恩夫韦肽技术领域，具体提供一种恩夫韦肽的合成方法和应用。该合成方法包括：以氨基树脂为载体树脂依次与恩夫韦肽第1～25个氨基酸对应的Fmoc‑氨基酸进行偶联反应、酸解，得到多肽片段SEQ ID NO：2；以羧基树脂为载体树脂依次与恩夫韦肽第26～36个氨基酸对应的Fmoc‑氨基酸进行偶联反应并接入乙酰基，酸解，得到多肽片段SEQ ID NO：3；将SEQ ID NO：3与丙酮叉保护的水杨醛进行缩合、脱除保护基，得到多肽片段SEQ ID NO：4；将SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：4进行丝氨酸多肽连接，经酸解，得到恩夫韦肽。本合成方法得到的恩夫韦肽具有纯度高、无消旋的特点。

The preparation method and application of enfwetide

【技术实现步骤摘要】
恩夫韦肽的制备方法和应用
本专利技术属于恩夫韦肽
，尤其涉及一种恩夫韦肽的合成方法和应用。
技术介绍
恩夫韦肽是人工合成的由36个氨基酸组成的链状多肽，其主要物理性质如下：白色或灰白色非晶型固体，在纯水中几乎不溶，但在pH＝7.5的缓冲液中溶解度达到82～142g/mL。分子式为C204H301N51O64，分子量为4492.01，其结构式为：CH3CO-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-NH2。结构序列为：SEQIDNO:1Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-CONH2。2003年3月13日，美国FDA经加快审批，宣布批准恩夫韦肽用于成人及6岁以上儿童的抗艾滋病治疗。该药由瑞士Roche公司与美国Trimeris公司联合研制开发，其商品名为Fuzeon，原名“T-20”，CASNumber:为159519-65-0。恩夫韦肽是近年来抗艾滋病治疗药的先锋，是第一个融合抑制剂。其它抗艾滋病药物是作用于细胞内部，阻止病毒在细胞内部复制，而这一药物却是通过阻止病毒与T细胞等免疫细胞的接触融合，干扰HIV-1进入T细胞，防止艾滋病患者的免疫系统遭受病毒破坏来发生作用，因此又称为融合抑制剂。现有恩夫韦肽制备工艺主要为固相与液相相结合的片段缩合工艺。具体是先使用二氯三苯甲基氯树脂制备每个片段肽树脂，经弱酸酸解，水沉淀过滤后得到保护的肽片段，在通过液相片段缩合，酸解，高效液相色谱纯化得到纯度为93-95％的产品。该方法片段缩合时存在溶解度低，易消旋等问题，每个片段需要纯化，杂质多，不适合规模化生产。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种恩夫韦肽的合成方法，以解决现有恩夫韦肽合成过程中存在的片段溶解度低、易消旋且杂质多，不易纯化等问题。进一步地，本专利技术还提供将该恩夫韦肽用于制备融合抑制剂的应用。本专利技术是这样实现的：一种恩夫韦肽的合成方法，包括以下步骤：步骤S01.以氨基树脂为载体树脂，依次与恩夫韦肽第1个至第25个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸进行偶联反应，得到全保护的多肽片段，酸解得到脱保护基后的多肽片段SEQIDNO：2；步骤S02.以羧基树脂为载体树脂，依次与恩夫韦肽第26个至第36个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸进行偶联反应，偶联反应结束接入乙酰基，酸解切割，得到多肽片段SEQIDNO：3；步骤S03.将多肽片段SEQIDNO：3与丙酮叉保护的水杨醛进行缩合反应，随后酸解脱除保护基，得到多肽片段SEQIDNO：4；步骤S04.将多肽片段SEQIDNO：2与多肽片段SEQIDNO：4溶于吡啶和醋酸的混合溶剂中进行丝氨酸多肽连接，经酸解，得到恩夫韦肽；其中，所述第1个至第25以及第26个至第36个氨基酸是指恩夫韦肽从CONH2端顺次至Ac端的各个氨基酸；SEQIDNO：2为：H2N-SQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-CONH2；SEQIDNO：3为：AcHN-YTSLIHSLIEE—COOH；SEQIDNO：4为：AcHN-YTSLIHSLIEE—COO—Ph—CHO。相应地，上述制备方法得到的恩夫韦肽在制备融合抑制剂的应用。本专利技术的有益效果如下：相对于现有技术，本专利技术提供的恩夫韦肽的合成方法，以两个片段进行丝氨酸多肽连接法制得产品，该方法两个片段的多肽连接溶解度好，反应条件温和，不需添加任何缩合试剂和活化试剂，只需要简单沉降过滤，即可得到高纯度的两条多肽片段，无消旋，中间体无需经过高效液相色谱纯化，制得的恩夫韦肽粗品纯度高达85％以上，最后经过分离，可得大于98％纯度的恩夫韦肽；本专利技术提供的方法生产工艺简单，更适合规模化工业化生产。本专利技术提供的恩夫韦肽在制备融合抑制剂中的应用，由于其使用的恩夫韦肽具有98％以上的纯度，因而得到的融合抑制剂纯度高，药效好。附图说明为了更清楚地说明本专利技术施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术提供的恩夫韦肽的合成路线示意图；Fmoc表示9-芴甲氧碳基；tBu表示叔丁基；OtBu表示氧叔丁基；Trt表示三苯甲基；Boc表示丁氧羰基；SPPS表示固相多肽合成；pyridine表示吡啶；Aceticacid表示乙酸。具体实施方式为了使本专利技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。请参阅图1，本专利技术提供一种恩夫韦肽的合成方法。该合成方法包括以下步骤：步骤S01.以氨基树脂为载体树脂，依次与恩夫韦肽第1个至第25个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸进行偶联反应，得到全保护的多肽片段，酸解得到脱保护基后的多肽片段SEQIDNO：2；步骤S02.以羧基树脂为载体树脂，依次与恩夫韦肽第26个至第36个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸进行偶联反应，偶联反应结束接入乙酰基，酸解切割，得到多肽片段SEQIDNO：3；步骤S03.将多肽片段SEQIDNO：3与丙酮叉保护的水杨醛进行缩合反应，随后酸解脱除保护基，得到多肽片段SEQIDNO：4；步骤S04.将多肽片段SEQIDNO：2与多肽片段SEQIDNO：4溶于吡啶和醋酸的混合溶剂中进行丝氨酸多肽连接，经酸解，得到恩夫韦肽；其中，所述第1个至第25以及第26个至第36个氨基酸是指恩夫韦肽从CONH2端顺次至Ac端的各个氨基酸；SEQIDNO：2为：H2N-SQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-CONH2；SEQIDNO：3为：AcHN-YTSLIHSLIEE—COOH；SEQIDNO：4为：AcHN-YTSLIHSLIEE—COO—Ph—CHO。下面对上述合成方法做进一步的解释说明：步骤S01中，涉及的氨基树脂可以是RinkAmide树脂、RinkAmideAM树脂、RinkMBHA树脂、Sieber树脂中的任一种。参与反应的氨基树脂的取代值为0.2～1.2mmol/g。优选氨基树脂的取代值为0.6～0.9mmol/g。本专利技术中氨基树脂依次与恩夫韦肽第1个至第25个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸进行偶联反应，指的是氨基树脂先与恩夫韦肽第1个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸进行偶联反应，得到的产物再与恩夫韦肽的第2个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸进行偶联反应，直至与恩夫韦肽的第25个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸进行偶联反应。在进行偶联反应之前，有必要去除对应Fmoc-氨基酸上的Fmoc保护，去Fmoc保护的试剂为体积含量为哌啶(PIP)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，其中哌啶的体积百分含量为15～25％，去Fmoc保护的试剂用量为每克氨基酸树脂中加入5～15mLPIP的DMF溶液。优选哌啶的体积百分含量为20％。在去Fmoc保护过程中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种恩夫韦肽的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S01.以氨基树脂为载体树脂，依次与恩夫韦肽第1个至第25个氨基酸对应的Fmoc‑氨基酸进行偶联反应，得到全保护的多肽片段，酸解得到脱保护基的多肽片段SEQ ID NO：2；步骤S02.以羧基树脂为载体树脂，依次与恩夫韦肽第26个至第36个氨基酸对应的Fmoc‑氨基酸进行偶联反应，偶联反应结束接入乙酰基，酸解切割，得到多肽片段SEQ ID NO：3；步骤S03.将多肽片段SEQ ID NO：3与丙酮叉保护的水杨醛进行缩合反应，随后酸解脱除保护基，得到多肽片段SEQ ID NO：4；步骤S04.将多肽片段SEQ ID NO：2与多肽片段SEQ ID NO：4溶于吡啶和醋酸的混合溶剂中进行丝氨酸多肽连接，经酸解，得到恩夫韦肽；其中，所述第1个至第25以及第26个至第36个氨基酸是指恩夫韦肽从CONH2端顺次至Ac端的各个氨基酸；SEQ ID NO：2为：H2N‑SQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF‑CONH2；SEQ ID NO：3为：AcHN‑YTSLIHSLIEE—COOH；SEQ ID NO：4为：AcHN‑YTSLIHSLIEE—COO—Ph—CHO。...

【技术特征摘要】
1.一种恩夫韦肽的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S01.以氨基树脂为载体树脂，依次与恩夫韦肽第1个至第25个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸进行偶联反应，得到全保护的多肽片段，酸解得到脱保护基的多肽片段SEQIDNO：2；步骤S02.以羧基树脂为载体树脂，依次与恩夫韦肽第26个至第36个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸进行偶联反应，偶联反应结束接入乙酰基，酸解切割，得到多肽片段SEQIDNO：3；步骤S03.将多肽片段SEQIDNO：3与丙酮叉保护的水杨醛进行缩合反应，随后酸解脱除保护基，得到多肽片段SEQIDNO：4；步骤S04.将多肽片段SEQIDNO：2与多肽片段SEQIDNO：4溶于吡啶和醋酸的混合溶剂中进行丝氨酸多肽连接，经酸解，得到恩夫韦肽；其中，所述第1个至第25以及第26个至第36个氨基酸是指恩夫韦肽从CONH2端顺次至Ac端的各个氨基酸；SEQIDNO：2为：H2N-SQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-CONH2；SEQIDNO：3为：AcHN-YTSLIHSLIEE—COOH；SEQIDNO：4为：AcHN-YTSLIHSLIEE—COO—Ph—CHO。2.如权利要求1所述的恩夫韦肽的合成方法，其特征在于，所述氨基树脂选自RinkAmide树脂、RinkAmideAM树脂、RinkMBHA树脂、Sieber树脂中的任一种；所述氨基树脂的取代值为0.2～1.2mmol/g；所述羧基树脂为二氯三苯甲基氯树脂、Wang树脂中的任一种；所述羧基树脂的取代值为0.3～1.5mmol/g。3.如权利要求1所述的恩夫韦肽的合成方法，其特征在于，步骤S01、步骤S02中的偶联反应中需加入缩合剂和活化剂，缩合剂和活化剂的加入量相等，其中，缩合剂选自N,N-二异丙基碳二亚胺、N,N－二环己基碳二亚胺、六氟磷酸苯并三唑-1-基－氧基三吡咯烷基磷、2-(7-氮杂-1H-...

【专利技术属性】
技术研发人员：骆亚，杨万鹏，黎露露，
申请(专利权)人：深圳佳肽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44