一种能保护及延长卵巢功能的多肽BPP及其应用制造技术

一种能保护及延长卵巢功能的多肽BPP及其应用，全序列为KETWWETWWTEWSQPKKKRKVQSK RAASIQRTSA。本发明专利技术序列为自主创新，既具有穿过细胞膜的功能，有能特异抑制内源PROM的活性。从而可以通过多种给药途径（肌肉注射，口服，加在化妆品中通过皮肤吸收等）达到保护及延长卵巢功能。能够保护化疗期青春期女性（20～34岁）因化疗药过度激活卵泡导致的卵巢早衰和生殖力下降甚至丧失。对卵巢贮备及生殖力开始显著下降的女性（35～37），延缓原始卵泡激活，提高生殖力，推迟更年期。

A polypeptide BPP that can protect and prolong ovarian function and its application

【技术实现步骤摘要】
一种能保护及延长卵巢功能的多肽BPP及其应用
本专利技术属于生殖医学领域，具体涉及一种能保护及延长卵巢功能的多肽BPP及其应用。
技术介绍
众所周知，女性卵巢是女性保持生殖力的关键器官，卵巢分泌的甾体激素(雌激素、雄激素、孕激素)也是女性保持身体各方面健康的重要因素之一。然而，卵巢的基本功能单位-卵泡，在女性出生前就开始不断激活和凋亡。而在临近更年期(45～50岁)时，残余卵泡不足以维持正常的生殖及激素分泌功能，从此后女性的衰老过程相比男性将急剧加快。mTOR信号通路是调节卵泡激活程度的关键通路，目前世界各地研究者主要在模式动物(小鼠、大鼠、猴等)上采用多种mTOR信号通路各环节激活性激酶的抑制剂来相对调低mTOR信号通路的活性而相对延缓卵泡激活。但是这些抑制剂均不具有靶向特异性，因而会造成一定的毒副作用。比如被用于延缓卵泡激活及延长寿命的雷帕霉素(rapamycin)是一种免疫抑制剂，可能会引发不良的代谢反应。因此下一代理想的药物应该是能较特异地抑制卵泡激活而不影响机体正常生理机能靶向药物。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术提供一种能保护及延长卵巢功能的多肽BPP及其应用，该多肽能够延缓卵巢早衰及自然衰老女性的卵巢中的卵泡激活，保护和延长女性生殖力，推迟女性更年期和延缓女性衰老。技术方案：一种能保护及延长卵巢功能的多肽BPP，全序列为KETWWETWWTEWSQPKKKRKVQSKRAASIQRTSA。上述多肽BPP在制备治疗卵巢早衰药物中的应用。上述多肽BPP在制备延缓卵泡激活药物中的应用。上述多肽BPP在制备提高卵巢生殖力保健品中的应用。上述多肽BPP在制备护肤品中的应用。对因化疗导致卵巢早衰的女性，在化疗前及化疗进行中口服BPP片剂，保护卵巢；也可用于35～37岁卵巢中原始卵泡贮备开始减少的女性，延长卵巢生殖力，推迟更年期和女性衰老。用药每天一次，1mg/kg。一个月为一疗程，疗程越长，效果越好。对上述两类女性进行肌肉注射，用药剂量和方案同上。由于BPP多肽中部分氨基酸有穿过细胞膜的功能，也可将BPP加入化妆品，护肤品中每日使用，通过皮肤吸收最后进入卵巢。有益效果：本专利技术序列为自主创新，既具有穿过细胞膜的功能，又能特异抑制内源PROM的活性。从而可以通过多种给药途径(肌肉注射，口服，加在化妆品中通过皮肤吸收等)达到保护及延长卵巢功能。能够保护化疗期青春期女性(20～34岁)因化疗药过度激活卵泡导致的卵巢早衰和生殖力下降甚至丧失。对卵巢贮备及生殖力开始显著下降的女性(35～37)，延缓原始卵泡激活，提高生殖力，推迟更年期。附图说明图1为PROM敲除雌鼠生殖力显著增加示意图。其中A、蛋白免疫印迹图，我们运用Cas9技术将PROM基因第9外显子整体删除。Westernblot(蛋白免疫印迹)显示与对照野生B6小鼠(+/+)相比，敲除小鼠(-/-)中PROM蛋白完全消失，证明敲除非常成功。GAPDH作为上样内参。B、PROM敲除对卵母细胞成熟及受精卵发育影响示意图，由图可知PROM敲除并不影响卵母细胞成熟及受精卵发育。C、PROM敲除雌鼠生殖力变化示意图，从6月龄开始，相比对照鼠，PROM敲除雌鼠生殖力显著增加。D、6月龄雌鼠卵巢切片，可知6月龄雌鼠卵巢切片显示敲除小鼠卵巢中各级卵泡显著增多。E、对6月龄雌鼠卵巢切片进行卵泡计数示意图，发现敲除小鼠卵巢中总卵泡数及原始卵泡均显著增加。图2、PROM作用机制研究图。其中A、特异磷酸化抗体制备示意图，我们用PROM抗体进行免疫沉淀→洗脱液磷酸化富集→磷酸化位点质谱鉴定发现两个相邻位点-Thr423&Ser424的磷酸化概率为99.8％，因此选取附近多肽序列QSKRAASIQR(pThr)(pSer)A制作特异磷酸化抗体。B、用抗体进行间接免疫荧光图，总PROM主要富集在卵母细胞膜上，磷酸化PROM(p-PROM)主要富集在纺锤体上。因此我们猜测膜上PROM被磷酸化激活后转位到纺锤体上。C、抗体免疫共沉淀后进行蛋白免疫印迹图，显示总PROM与Lck相互作用图。D、蛋白免疫印迹图显示，抑制Lck激酶活性后，p-PROM水平显著降低，说明Lck负责磷酸化激活PROM。Actin作为上样内参。E、蛋白免疫印迹图显示，与对照卵母细胞相比，PROM敲除卵中p-mTOR和p-rps6水平显著降低。Actin作为上样内参。F、PROM作用机制模式图。图3、BPP可以高效进入卵母细胞及卵巢图。我们设想，穿膜肽融合PROM磷酸化位点附近多肽而合成的BPP可以与内源PROM竞争被磷酸化，而发挥与PROM敲除类似的效应。其中A、…绿色荧光标记(FITC)的BPP在体外培养的卵母细胞中的分布图，我们将BPP简单添加到培养液中就可以高效进入体外培养的卵母细胞中。可以看到，对照(上)卵母细胞中荧光很低，而加FITC-BPP后卵母细胞中绿色荧光显著增强。B、绿色荧光标记(FITC)的BPP在体外培养的卵巢中的分布图，我们将BPP简单添加到培养液中也可以高效进入体外培养的卵巢中。可以看到，对照(上)卵巢中荧光很低，而加FITC-BPP后卵巢中绿色荧光显著增强。C、绿色荧光标记(FITC)的BPP在体内卵巢中的分布图，其中通过腹腔注射，BPP也可以高效进入小鼠卵巢中。可以看到，对照(上)卵巢中荧光很低，而加FITC-BPP后卵巢中绿色荧光显著增强。蓝色通道是DNA染色，也可显示卵巢的整体结构。D、腹腔注射BPP的Westernblot显示图，可以看出腹腔注射的BPP可以抑制内源PROM的磷酸化而导致p-PROM水平降低。GAPDH作为上样内参。Ctr为对照鼠，CPP为不含特异BPP序列的对照穿膜肽。图4、考察BPP药物典型的剂量依赖性和时间依赖性示意图。其中，A、给小鼠腹腔注射1～3mg/Kg的BPP，24小时后血液中浓度呈现典型的剂量依赖性示意图。B、给小鼠腹腔注射1mg/Kg的BPP，在不同时间点血液中浓度呈现典型的时间依赖性示意图。图5、BPP对化疗导致卵巢早衰的小鼠的生殖力影响示意图。其中A、内源p-PROM的水平图，我们用环磷酰胺(CPA)腹腔注射制作卵巢早衰小鼠模型，同时注射BPP看其是否可以抑制p-mTOR而抑制卵巢早衰。Westernblot显示BPP与CPA一起注入小鼠也可显著降低内源p-PROM水平。GAPDH作为上样内参。B、持续超6个月的生殖力鉴定显示图，CPA导致雌鼠几乎完全丧失生殖力(图表中最低线)，而BPP与CPA共同注射显著恢复了雌鼠生殖力(图表中中间线)。C、卵泡计数图，显示BPP与CPA共同注射显著恢复了CPA导致的各级卵泡减少。图6、BPP有延缓退役雌鼠卵泡激活和提高生殖力的作用图。A、生殖力鉴定结果显示，BPP腹腔注射组小鼠生殖力高于CPP对照组。B、Westernblot图显示，BPP腹腔注射显著降低了内源p-PROM的水平。GAPDH作为上样内参。Ctr为对照老龄鼠，CPP为不含特异BPP序列的对照穿膜肽。C、卵巢石蜡切片进行苏木精-伊红染色图，其中蓝色染DNA，粉红色染胞质。卵巢切片显示BPP腹腔注射显著增加了各级卵泡。D、卵泡计数显示BPP腹腔注射显著增加了各级卵泡数。E、卵巢mRNA测序图，显示BPP腹腔注射将退役鼠卵巢的R本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能保护及延长卵巢功能的多肽BPP，其特征在于全序列为KETWWETWWTEWSQPKKKRKVQSKRAASIQRTSA。

【技术特征摘要】
1.一种能保护及延长卵巢功能的多肽BPP，其特征在于全序列为KETWWETWWTEWSQPKKKRKVQSKRAASIQRTSA。2.权利要求1所述多肽BPP在制备治疗卵巢早衰药物中...

【专利技术属性】
技术研发人员：张东，杨志霞，孙青原，朱峰宇，王利利，朱刚毅，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32