一种构建花生子叶再生体系的方法技术

本发明专利技术涉及植物组织培养技术领域，具体公开一种构建花生子叶再生体系的方法，包括以下几个步骤：(1)预处理；(2)灭菌；(3)愈伤组织培养；(4)丛生芽诱导；(5)增殖培养；(6)壮苗培养；(7)生根培养；(8)移栽。本发明专利技术提供的构建稳定花生子叶再生体系的方法，为花生遗传转化及分子育种提供了新技术和方法。

A method of constructing peanut cotyledon regeneration system

【技术实现步骤摘要】
一种构建花生子叶再生体系的方法
本专利技术涉及植物组织培养
，具体公开一种构建花生子叶再生体系的方法。
技术介绍
花生是一年生草本豆科作物，优质食用油主要原料品种之一，民间又称“长生果”。花生作为我国重要的农作物，不仅自身营养价值丰富，而且具有很高的经济价值。植物组织培养技术是花生品种改良、新品种繁殖、遗传转化、种质保存和抗性突变体的筛选等方面研究的基础。近些年来，已有较多通过对花生未成熟胚、子叶、茎尖、胚轴、叶片、花粉等作为外置体进行花生离体培养而获得再生植株的报道。但是，花生再生体系的建立尚不成熟，再生体系建立难度大，仍然存在不同基因型间再生差异大、畸形苗较多、再生频率低、生长慢、生根难等许多尚未解决的问题。同时，根据已公布的国内外研究结果(表1)，将其配方应用到我国所用的几种花生品种中，进行重复实验发现结果并不理想。其中，以“四粒红”花生的子叶作为外植体，按照王允&殷冬梅、Livingstone&Birch、何红卫&宾金华等培养基没有诱导出丛生芽。同时，郝浩永等(2007)报道丛生芽在1/2MS+NAA1.0mg.L-1+0.7％琼脂培养基上生根率最高达95％以上，但按照该配方，“四粒红”花生再生苗的生根率为20-40％左右，且生根质量差，须根数少。表1花生组织培养的研究成果
技术实现思路
针对上述存在问题，本专利技术提供一种构建稳定花生子叶再生体系的方法，为花生遗传转化及育种提供了新技术和方法。本专利技术提供的构建花生子叶再生体系的方法，具体包括以下几个步骤：(1)预处理：选取成熟“四粒红”花生种子用无菌水浸泡；(2)灭菌：将预处理后的种子用乙醇溶液浸泡，再用HgCl2溶液消毒，然后用无菌水冲洗；(3)愈伤组织培养：将灭菌后的种子剥离胚芽，子叶接种到愈伤组织诱导培养基上，白光照射，并补红光光照，再加盖两层报纸，使500lux<光照强度<1000lux，在25℃条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20天；(4)丛生芽诱导：将步骤(3)中培养得到的材料转接种于丛生芽诱导培养基上，白光照射，并补红光光照，再加盖两层报纸，使500lux<光照强度<1000lux，在25℃条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养30天；(5)增殖培养：将步骤(4)培养材料转接到增殖培养基中培养，在25℃、光照度2000lux-4000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20-40天；(6)壮苗培养：将步骤(5)培养材料转接到壮苗培养基中培养，在25℃、光照度2000lux-4000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20-40天；(7)生根培养：将步骤(6)中培养茎高为1.5-3cm的再生苗转接至生根培养基上诱导生根，在25℃、光照度2000lux-4000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20-40天；(8)移栽：待花生再生苗诱导的根长长到1.2-2.0cm时，用医用尖嘴镊子小心地将三角瓶内的琼脂分成小块，并不损伤根系；然后，用蒸馏水冲洗再生苗根系，移栽至营养钵中，覆盖塑料薄膜，在25℃、光照度4000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养7天，并保持基质湿润，由于前期培养均在高湿环境中进行，故前7天保持基质湿润可使移栽苗逐渐适应环境，提高成活率；14d后，去除覆盖材料，在25℃、光照度6000lux下自然生长。优选地，步骤(1)中所述无菌水浸泡时间为2-4h。优选地，步骤(2)中所述灭菌过程为：用质量分数为75％乙醇溶液浸泡30s，再用质量分数为0.1％HgCl2溶液消毒8-10min，然后用无菌水冲洗4-5次，每次4-5min。优选地，步骤(3)中所述愈伤组织诱导培养基的组分为：MS+2mg/LTDZ+0.8mg/L6-BA+1mg/LNAA。优选地，步骤(4)中所述丛生芽诱导培养基的组分为：MS+TDZ4mg/L+NAA1mg/L+GA30.5mg/L。优选地，步骤(3)和步骤(4)中加盖报纸前所述白光与所述红光光照强度均为1500lux-2000lux。优选地，步骤(5)中所述增殖培养基的组分为：MS+4mg/L6-BA+3mg/lGA3。优选地，步骤(6)中所述壮苗培养基的组分为：MS+1.0mg/LNAA+4.0mg/L6-BA+0.5mg/LGA3。优选地，步骤(7)中所述生根培养基的组分为1/2MS+4.0mg/LNAA+0.4mg/LGA3。对比现有技术，本专利技术的有益效果为：(1)本申请提供的构建花生子叶再生体系的方法，使用诱导培养基MS+TDZ4mg/L+NAA1mg/L+GA30.5mg/L，并结合白色日光灯、补红光光照，再加盖两层报纸的培养条件，将“四粒红”花生子叶丛生芽诱导率由原来的30％左右提高到85％以上；其中，采用加盖两层报纸的少光培养方式，与无光或完全光照相比，可以显著促进花生子叶胚性愈伤组织的形成；(2)刚诱导出的丛生芽，有的茎和叶片显示畸形，且增殖系数低，一般每个外植体出芽数为1-4个，将其转接到增殖培养基MS+4mg/L6-BA+3mg/lGA3，增值系数明显增多，培养20-40天，每个子叶出芽数均大于10；且叶片、茎生长正常。(3)生根培养基的组分为1/2MS+4.0mg/LNAA+0.4mg/LGA3，培养20-40天，生根率为66.67％，随着继代培养时间的延长，生根率可以达到100％，且生出的根系较粗，有利于移栽成活。附图说明图1是实施例3中花生子叶剥离图；图2是实施例3中子叶不定芽诱导图；其中，A是愈伤组织，B是诱导出不定芽；图3是实施例3中子叶增殖和壮苗图；其中，A是增殖苗，B是壮苗；图4是实施例3中花生再生苗生根诱导图；其中，A是在培养基里生长的花生苗，B是移栽时洗出后的苗；图5是实施例3中再生苗驯化移栽图；其中A是刚移栽时的花生苗，B是移栽35天后开花前的花生苗，C是移栽后40天开花的花生苗。具体实施方式为了使本领域技术人员更好地理解本专利技术的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本专利技术作进一步说明，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。实施例1一种构建花生子叶再生体系的方法，具体包括以下几个步骤：(1)预处理：选取成熟的“四粒红”花生种子用无菌水浸泡2h；(2)灭菌：将预处理后的种子用质量分数为75％的乙醇溶液浸泡30s，然后用质量分数为0.1％的HgCl2溶液消毒8min，用无菌水冲洗4次，每次4min；(3)愈伤组织培养：将灭菌后的种子剥离胚芽，子叶从中间切开接种到愈伤组织诱导培养基上，白色日光灯照射，并补红光光照，再加盖两层报纸，使花生子叶接受到的光照度为500lux；在25℃条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20天；其中，加盖报纸前白光与红光光照强度均为1500lux；愈伤组织诱导培养基的组分为：MS+2mg/LTDZ+0.8mg/L6-BA+1mg/LNAA；(4)丛生芽诱导：将步骤(3)中培养得到的材料转接种于丛生芽诱导培养基上，白色日光灯照射，并补红光光照，再加盖两层报纸，使培养基接受到的光照度为500lux；在25℃条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20天；丛生芽诱导培养基的组分为：MS+TDZ4mg/L+NAA1mg/L+GA30.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建花生子叶再生体系的方法，其特征在于，包括以下几个步骤：(1)预处理：选取成熟“四粒红”花生种子用无菌水浸泡；(2)灭菌：将预处理后的种子用乙醇溶液浸泡，再用HgCl2溶液消毒，然后用无菌水冲洗；(3)愈伤组织培养：将灭菌后的种子剥离胚芽，子叶接种到愈伤组织诱导培养基上，白光照射，并补红光光照，再加盖两层报纸，使500lux<光照强度<1000lux，在25℃条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20天；(4)丛生芽诱导：将步骤(3)中培养得到的材料转接种于丛生芽诱导培养基上，白光照射，并补红光光照，再加盖两层报纸，使500lux<光照强度<1000lux，在25℃条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养30天；(5)增殖培养：将步骤(4)培养材料转接到增殖培养基中培养，在25℃、光照度2000lux‑4000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20‑40天；(6)壮苗培养：将步骤(5)培养材料转接到壮苗培养基中培养，在25℃、光照度2000lux‑4000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20‑40天；(7)生根培养：将步骤(6)中培养茎高为1.5‑3cm的再生苗转接至生根培养基上诱导生根，在25℃、光照度2000lux‑4000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20‑40天；(8)移栽：待花生再生苗诱导的根长长到1.2‑2.0cm时，冲洗再生苗根系，移栽，在25℃、光照度4000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养14天后，在25℃、光照度6000lux条件下自然生长。...

【技术特征摘要】
1.一种构建花生子叶再生体系的方法，其特征在于，包括以下几个步骤：(1)预处理：选取成熟“四粒红”花生种子用无菌水浸泡；(2)灭菌：将预处理后的种子用乙醇溶液浸泡，再用HgCl2溶液消毒，然后用无菌水冲洗；(3)愈伤组织培养：将灭菌后的种子剥离胚芽，子叶接种到愈伤组织诱导培养基上，白光照射，并补红光光照，再加盖两层报纸，使500lux<光照强度<1000lux，在25℃条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20天；(4)丛生芽诱导：将步骤(3)中培养得到的材料转接种于丛生芽诱导培养基上，白光照射，并补红光光照，再加盖两层报纸，使500lux<光照强度<1000lux，在25℃条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养30天；(5)增殖培养：将步骤(4)培养材料转接到增殖培养基中培养，在25℃、光照度2000lux-4000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20-40天；(6)壮苗培养：将步骤(5)培养材料转接到壮苗培养基中培养，在25℃、光照度2000lux-4000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20-40天；(7)生根培养：将步骤(6)中培养茎高为1.5-3cm的再生苗转接至生根培养基上诱导生根，在25℃、光照度2000lux-4000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20-40天；(8)移栽：待花生再生苗诱导的根长长到1.2-2.0cm时，冲洗再生苗根系，移栽，在25℃、光照度4000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养14天后，在25℃、光照...

【专利技术属性】
技术研发人员：余如刚，杜雪玲，宋运贤，王国良，杨星，蒋晓晓，陈涛，李静，管方园，刘兰，梅雪珂，
申请(专利权)人：淮北师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34