前列腺癌细胞LNCaP的FASN基因长短不同转录本的获取及定量方法技术

本发明专利技术公开前列腺癌细胞LNCaP的FASN基因长短不同转录本的获取和定量方法，使用3’RACE试剂盒对前列腺癌细胞LNCaP的RNA进行反转录，接下来采用套式PCR上游特异性引物和下游通用引物，通过3’RACE实验获取LNCaP细胞中FASN基因长转录本和短转录本；使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒对前列腺癌细胞LNCaP的RNA进行反转录，使用FASN基因长转录本和FASN基因短转录本的两对特异性引物进行qPCR实验，定量FASN基因长转录本和短转录本；本发明专利技术首次发现FASN基因有多个转录本存在的现象，同时通过新的qPCR引物特异性地定量FASN基因长转录本和短转录本。

Acquisition and quantitative method of different transcripts of FASN gene length of LNCaP in prostate cancer cells

【技术实现步骤摘要】
前列腺癌细胞LNCaP的FASN基因长短不同转录本的获取及定量方法
本专利技术涉及前列腺癌细胞LNCaP的FASN基因长短不同转录本的获取及定量方法，属于生物检测

技术介绍
雄性激素DHT在前列腺癌发生发展的过程中起着重要作用，DHT通过结合雄性激素受体，从细胞质转入到细胞核中，在核中与靶基因的雄性激素响应元件结合，使前列腺癌细胞中大量基因在转录水平、蛋白水平上发生剧烈波动。在DHT刺激下，许多基因转录本和表达量会发生变化，包括前列腺癌细胞LNCaP的FASN基因，该基因编码的酶是一种多功能蛋白，在长链饱和脂肪酸的合成中发挥重要作用，与正常前列腺组织相比，人类前列腺癌中FASN基因的表达水平明显较高，该基因具有前列腺癌原癌基因的特性，其表达量的上下调与细胞增殖、凋亡、黏附、迁移和侵袭等密切有关，因此它被认为是前列腺癌进展的生物标志物，在以往的研究中，对FASN转录本的检测并未发现多个不同的转录本，所以目前还没有FASN基因不同转录本的相关研究。
技术实现思路
本专利技术提供前列腺癌细胞LNCaP的FASN基因长短不同转录本的获取方法，具体步骤如下：使用3’RACE试剂盒对前列腺癌细胞LNCaP的RNA进行反转录，接下来采用套式PCR上游特异性引物和下游通用引物，通过3’RACE实验获取LNCaP细胞中FASN基因长转录本和短转录本。所述上游特异性引物为5’-GCTGAGCAGTACACACCCAAG-3’和5’-CCCAGGTATGCGACGGGAAAGTATC-3’。所述下游通用引物为试剂盒通用引物，试剂盒为3’-FullRACECoreSetwithPrimeScriptTMRTase试剂盒。本专利技术还提供前列腺癌细胞LNCaP的FASN基因不同转录本的定量方法，具体步骤如下：使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)试剂盒对前列腺癌细胞LNCaP的RNA进行反转录，使用FASN基因长转录本和FASN基因短转录本的特异性引物进行qPCR实验，定量FASN基因长转录本和短转录本。所述FASN基因长转录本的特异性引物为5’-TGTTTGGTGTTTGTCTGTGTTTG-3’和5’-CGGTTTAATTGTGGGAGGCT-3’。所述FASN基因短转录本的特异性引物为5’-CCGCTGAGCAGTACACACC-3’和5’-CGTCGCATACCTGGGAGA-3’。现有研究未能对前列腺癌细胞LNCaP的FASN基因的多个转录本进行有效鉴定，本专利技术设计特异引物，进行3’RACE实验，可以快速准确的鉴定出到FASN的不同长短转录本。目前没有关于FASN长短转录本表达量检测的qPCR方法报道，本专利技术设计特异性引物进行qPCR试验可以准确确定FASN基因长短转录本的表达量，从而观察在不同条件下FASN-L及FASN-S的表达变化。本专利技术通过专利技术新的特异的3’RACE套式PCR上游特异性引物和下游通用引物获取到新的FASN转录本，并且通过新的qPCR引物特异性地定量FASN长短转录本(FASN-L、FASN-S)。本专利技术首次发现该FASN基因有长短转录本存在的现象，而且受到前列腺癌主要诱发因素的雄性激素刺激后，FASN基因偏好使用短转录本，使得FASN基因逃逸了miRNAs对它的调控作用，最终导致基因和蛋白的表达量上调。附图说明图1为实施例1中3’RACE琼脂糖凝胶DNA电泳图对应的FASN的不同转录本条带(a)；其对应的选择性多聚腺苷酸化位点测序验证结果(b)；图2为实施例2中长转录本和短转录本在不同浓度DHT处理下的定量结果。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术的保护范围并不限于所述内容。本专利技术中所涉及到的缩写说明如下：PCR：PolymeraseChainReaction/聚合酶链式反应；qPCR：Real-timeQuantitativePCR/实时荧光定量PCR；3’RACE：Rapidamplificationof3'cDNAends/3’cDNA末端快速扩增技术；RNA：RibonucleicAcid/核糖核；FASN：Fattyacidsynthase/脂肪酸合成酶；DHT：Dihydrotestosterone/二氢睾酮。实施例1前列腺癌细胞LNCaP的FASN基因不同转录本的获取方法，具体步骤如下：(1)设计套式PCR上游特异性引物，序列分别为5’-GCTGAGCAGTACACACCCAAG-3’(GeneSpecificOuterPrimer)和5’-CCCAGGTATGCGACGGGAAAGTATC-3’(GeneSpecificInnerPrimer)；(2)培养LNCaP细胞，LNCaP细胞购自昆明动物所细胞库，培养流程如下：1)细胞实验开始前开启紫外灯照射30min，并提前准备好需要的仪器试剂，确保无菌环境；2)使用改良型RPMI1640培养基，加入质量分数10％胎牛血清(fetalbovineserum，ThermoFisherScientific，货号：10099141)和质量分数1％青霉素-链霉素(ThermoFisherScientific，货号：15140122)的DMEM培养基(Dulbecco’smodifiedEaglemedium，ThermoFisherScientific，货号：11965084)配置完全培养基；3)取出购置的LNCaP细胞，使用4mL的PBS清洗两次；4)对贴壁细胞使用1mL的胰蛋白酶进行消化；5)当贴壁细胞大部分脱落时，加入2mL完全培养基，终止消化；6)对混合液进行多次吹打，避免细胞成团；7)将上述混合液转移至干净的离心管中，1000rpm离心5min；8)吸除上清液，加入10mL完全培养基，将细胞沉淀吹打均匀；9)在6孔板中按照每孔2mL完全培养基的量接种2-4×105个细胞，37℃、5％CO2恒温培养箱中培养24h，保证24h后细胞的汇合度达到50％-70％；10)使用无水乙醇提前配置好用于处理细胞浓度为0μM、1μM的DHT处理液，储存干净无菌的15mL离心管；11)换液，按每孔2mL的体积重新加入新的上述完全培养基到各个培养孔中；12)向每个处理孔加入2μLDHT处理液，缓慢摇晃6孔板，混匀后的DHT终浓度为0nM、1nM；置于37℃、5％CO2恒温培养箱中培养48h；(3)使用Qiagen公司生产的PlusMiniKit，按试剂盒说明提取不同浓度下LNCaP前列腺癌细胞的RNA；(4)按3’-FullRACECoreSetwithPrimeScriptTMRTase试剂盒说明书要求进行实验，具体流程如下：1)反转录反应：放置到PCR仪上进行如下反应：温度时间42℃60min70℃15min2)OuterPCR反应：在ABIPCR仪上按如下反应条件进行反应：3)InnerPCR反应：置于ABIPCR仪上进行如下反应：(5)电泳检测；(6)切胶回收，连接PMD18-载体进行测序；获得FASN基因长短不同转录本(FASN-L、FASN-S)。图1为本实施例中电泳检测得到的琼脂糖凝胶DNA电泳图对应的FASN的不同转录本条本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.前列腺癌细胞LNCaP的FASN基因长短不同转录本的获取方法，其特征在于，具体步骤如下：使用3’RACE试剂盒对前列腺癌细胞LNCaP的RNA进行反转录，接下来采用套式PCR上游特异性引物和下游通用引物，通过3’RACE实验获取LNCaP细胞中FASN基因长转录本和短转录本。

【技术特征摘要】
1.前列腺癌细胞LNCaP的FASN基因长短不同转录本的获取方法，其特征在于，具体步骤如下：使用3’RACE试剂盒对前列腺癌细胞LNCaP的RNA进行反转录，接下来采用套式PCR上游特异性引物和下游通用引物，通过3’RACE实验获取LNCaP细胞中FASN基因长转录本和短转录本。2.根据权利要求1所述前列腺癌细胞LNCaP的FASN基因长短不同转录本的获取方法，其特征在于，所述上游特异性引物为5’-GCTGAGCAGTACACACCCAAG-3’和5’-CCCAGGTATGCGACGGGAAAGTATC-3’。3.根据权利要求1所述前列腺癌细胞LNCaP的FASN基因长短不同转录本的获取方法，其特征在于，所述下游通用引物为试剂盒通用引物，试剂盒为3’-FullRACECoreSetwithPrimeScriptTMRTase试剂盒。4.前列腺癌细胞LNCaP的FASN基因长短不同转录本...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵卉，孙伟杰，张亚平，
申请(专利权)人：云南大学，
类型：发明
国别省市：云南,53