抗肿瘤融合蛋白及其制法和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种抗肿瘤融合蛋白及其制法和应用。具体地，本发明专利技术提供了一种包括GnRH蛋白元件、PEA蛋白的跨膜转运区和P53蛋白元件的融合蛋白，所述融合蛋白可以高效地将p53蛋白输送到细胞核并高效引发肿瘤细胞凋亡。本发明专利技术还提供了编码所述融合蛋白的核苷酸、生产所述融合蛋白的方法以及包含所述融合蛋白的药物组合物。

Antitumor fusion protein and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
抗肿瘤融合蛋白及其制法和应用
本专利技术涉及生物医药领域，更具体地涉及一种抗肿瘤融合蛋白及其制法和应用。
技术介绍
免疫毒素是一组人工构建的具有特异性细胞杀伤能力的杂合分子，由毒性部分、载体部分和靶向部分三部分组成。毒性部分可以是植物、动物、微生物来源的细胞毒素，靶向部分可以是单克隆抗体或细胞因子。免疫毒素与其他抗肿瘤药物相比，具有毒性强和特异性高的优点，在肿瘤治疗中显示出巨大的应用前景。冻干重组人促黄体激素释放激素-绿脓杆菌外毒素A融合蛋白(lyophilizedrecombinanthumanluteinizinghormonereleasinghormone-exotoxinofpseudomonasaeruginosafusionprotein,简称LHRH-PE40)是长春基因工程药物研究生产的一种对肿瘤细胞有特异性杀伤作用的重组毒素。其生产方法为首先采用基因工程的方法将编码绿脓杆菌外毒素A基因的受体结合区(I区)切除，置换成LHRH基因，再将LHRH-PE40重组基因克隆于质粒中，通过工程发酵表达出LHRH-PE40融合蛋白。LHRH-PE40中发挥细胞毒作用的是绿脓杆菌外毒素A(exotoxinAofpseudomonasaeruginosa,PEA)。绿脓杆菌外毒素A是绿脓杆菌中毒力最强的一种毒素，能阻断细胞蛋白质的合成并引起细胞的凋亡。LHRH-PE40中的导向物为人促黄体激素释放激素(humanluteinizinghormonereleasinghormone,LHRH)，通过与其在肿瘤细胞表面的I型受体结合而靶向性地把PEA导入到肿瘤细胞中发挥抗肿瘤作用。LHRH的受体有两型，即I型和II型。LHRH与I型受体的亲和力很高。人体正常情况下，I型受体主要存在于垂体前叶，垂体外组织如性腺、胎盘和脑组织也含有一定量的I型受体，其它重要器官均不表达I型LHRH受体。然而某些肿瘤细胞表面由于受体异化则分布着大量的LHRHI型受体，包括生殖系统恶性肿瘤、黑色素瘤、胃癌、肝癌、胰腺癌、肠癌、肺癌等。由于I型LHRH受体在肿瘤细胞中普遍高表达，而在正常组织中只呈局限性分布，因此LHRH是设计重组靶向毒素所需的理想导向物。LHRH的II型受体广泛存在于人体各组织中。LHRH与II型受体的亲和力很低。但在很高剂量的情况下，LHRH可以和II型受体发生低亲和力结合，从而使LHRH-PE40产生广泛的细胞毒作用。这是LHRH-PE40重组毒素对动物产生毒性作用的理论基础。LHRH-PE40不能透过血脑屏障，因此不会对垂体产生毒性作用。尽管以LHRH-PE40为代表的免疫毒素显示出良好的应用前景,但其仍存在免疫原性和非特异的细胞毒性等问题,阻碍了免疫毒素在临床上的应用。因此，本领域迫切需要开发特异性好、细胞毒性低的新的免疫毒素。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抗肿瘤融合蛋白及其制法和应用。在本专利技术的第一方面，提供了一种抗肿瘤融合蛋白，所述的抗肿瘤融合蛋白具有式I所述结构：D-A-B-C-E(I)其中，A为GnRH蛋白元件；B为PEA蛋白的跨膜转运区或为无；C为P53蛋白元件；E为TAT蛋白元件或为无；D为任选的信号肽和/或前导肽序列；并且，B和E不同时为无；其中，“-”表示连接上述各元件的肽键。在另一优选例中，所述的抗肿瘤融合蛋白具有式II所述结构：D-A-C-E(II)其中，A为GnRH蛋白元件；C为P53蛋白元件；E为TAT蛋白元件；D为任选的信号肽和/或前导肽序列；其中，“-”表示连接上述各元件的肽键。在另一优选例中，所述的抗肿瘤融合蛋白在另一优选例中，所述的TAT为HIV-I编码的一段富含碱性氨基酸的短肽。在另一优选例中，所述的TAT蛋白来源于人或非人哺乳动物。在另一优选例中，所述的TAT蛋白包括野生型和突变型。在另一优选例中，所述的TAT蛋白包括全长的、成熟形式的P53，或其活性片段。在另一优选例中，所述的TAT蛋白的序列如SEQIDNO.:5中第405-416位所示。在另一优选例中，所述的抗肿瘤融合蛋白的在另一优选例中，所述的抗肿瘤融合蛋白选自下组：(A)具有SEQIDNO.:5所示氨基酸序列的多肽；(B)具有与SEQIDNO.:5所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如98％以上，99％以上)的多肽，且所述多肽具有抑制肿瘤细胞生长的活性；(C)将SEQIDNO:5所示氨基酸序列经过1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留抑制肿瘤细胞生长活性的衍生多肽。在另一优选例中，所述的抗肿瘤融合蛋白具有式II所述结构：D-A-B-C(II)其中，A为GnRH蛋白元件；B为PEA蛋白的跨膜转运区；C为P53蛋白元件；D为任选的信号肽和/或前导肽序列；“-”表示连接上述各元件的肽键。在另一优选例中，所述的GnRH蛋白来源于人或非人哺乳动物。在另一优选例中，所述的GnRH蛋白包括野生型和突变型。在另一优选例中，所述的GnRH蛋白包括全长的、成熟形式的GnRH，或其活性片段。在另一优选例中，所述的GnRH蛋白包括II型GnRH蛋白和I型GnRH蛋白。在另一优选例中，所述的GnRH蛋白为II型GnRH蛋白。在另一优选例中，所述的GnRH蛋白的序列如SEQIDNO.:2中第1-10位所示。在另一优选例中，所述的P53蛋白来源于人或非人哺乳动物。在另一优选例中，所述的P53蛋白包括野生型和突变型。在另一优选例中，所述的P53蛋白包括全长的、成熟形式的P53，或其活性片段。在另一优选例中，所述的P53蛋白的序列如SEQIDNO.:2中第128-520位所示。在另一优选例中，所述PEA蛋白的跨膜转运区来源于绿脓杆菌。在另一优选例中，所述PEA蛋白的跨膜转运区的长度为100-120氨基酸，较佳地为100-115个氨基酸。在另一优选例中，所述PEA蛋白的跨膜转运区的序列如SEQIDNO.:2中第13-127位所示。在另一优选例中，所述的抗肿瘤融合蛋白是由细菌，较佳地由大肠杆菌表达的重组蛋白。在另一优选例中，所述的抗肿瘤融合蛋白是不经糖基化修饰的蛋白。在另一优选例中，所述的抗肿瘤融合蛋白选自下组：(A)具有SEQIDNO.:2所示氨基酸序列的多肽；(B)具有与SEQIDNO.:2所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如98％以上，99％以上)的多肽，且所述多肽具有抑制肿瘤细胞生长的活性；(C)将SEQIDNO:2所示氨基酸序列经过1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留抑制肿瘤细胞生长活性的衍生多肽。在另一优选例中，所述的肿瘤细胞为表达GnRHR的肿瘤细胞，较佳地为表达I型GnRHR的肿瘤细胞。在另一优选例中，所述的肿瘤细胞为表达II型GnRHR的肿瘤细胞。在另一优选例中，所述抗肿瘤融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。在另一优选例中，所述抗肿瘤融合蛋白含有6xHis纯化标签。在另一优选例中，所述抗肿瘤融合蛋白能够抑制肿瘤细胞生长和/或诱导肿瘤细胞的凋亡在本专利技术的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本专利技术第一方面所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗肿瘤融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白具有式I所述结构：D‑A‑B‑C‑E      (I)其中，A为GnRH蛋白元件；B为PEA蛋白的跨膜转运区或为无；C为P53蛋白元件；E为TAT蛋白元件或为无；D为任选的信号肽和/或前导肽序列；并且，B和E不同时为无；其中，“‑”表示连接上述各元件的肽键。

【技术特征摘要】
1.一种抗肿瘤融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白具有式I所述结构：D-A-B-C-E(I)其中，A为GnRH蛋白元件；B为PEA蛋白的跨膜转运区或为无；C为P53蛋白元件；E为TAT蛋白元件或为无；D为任选的信号肽和/或前导肽序列；并且，B和E不同时为无；其中，“-”表示连接上述各元件的肽键。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白具有式II所述结构：D-A-B-C(II)其中，A为GnRH蛋白元件；B为PEA蛋白的跨膜转运区；C为P53蛋白元件；D为任选的信号肽和/或前导肽序列；“-”表示连接上述各元件的肽键。3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的GnRH蛋白包括II型GnRH蛋白和I型GnRH蛋白。4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的融...

【专利技术属性】
技术研发人员：颜浩为，侯天全，
申请(专利权)人：颜浩为，侯天全，
类型：发明
国别省市：吉林,22