本发明专利技术公开了一种聚乙二醇化的双特异性抗体，包含(a)抗原结合片段(Fab)，其具有轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)，以及重链可变区(VH)和部分重链恒定区(CH1)；(b)融合至所述抗原结合片段(Fab)的部分重链恒定区(CH1)的C端的单域抗原结合片段(VHH)，以及(c)融合至所述抗原结合片段(Fab)的轻链恒定区(CL)的C端的聚乙二醇(PEG)。聚乙二醇化的S‑Fab(PEG‑S‑Fab)保留了肿瘤细胞和T细胞的结合。PEG‑S‑Fab增强了血浆稳定性并使S‑Fab的半衰期增加了12倍。PEG‑S‑Fab在异种移植小鼠模型中也具有更有效的肿瘤抑制效力。这些数据表明聚乙二醇化可能是增强双特异性抗体的抗肿瘤特性的有效方法。
Bispecific antibody with extended half-life and enhanced antitumor effect
【技术实现步骤摘要】
具有延长的半衰期和增强的抗肿瘤效果的双特异性抗体
本专利技术涉及双特异性抗体，具体涉及具有延长的半衰期和增强的抗肿瘤效果的聚乙二醇化的双特异性抗体。
技术介绍
双特异性抗体是癌症免疫治疗中的一种强有力的手段，其将免疫细胞直接与癌细胞结合。双特异性抗体有两个不同的抗原结合位点，一个识别肿瘤细胞，另一个识别免疫细胞(通常是T细胞或自然杀伤(NK)细胞)。双特异性抗体存在多种形式，包括基于IgG的全长形式(例如完整的双特异性抗体)、基于单链的形式(包括串联单链可变片段(ScFv))和双特异性T细胞衔接体(BiTE)。为了增强全长IgG抗体的肿瘤组织渗透并提高ScFv和BiTE的稳定性，开发了双特异性单域抗体连接的Fab(S-Fab)形式，其可以结合不同的表位并使用原核表达系统。衍生自天然骆驼重链抗体的单结构域抗体缺乏第一个恒定(CH1)结构域和轻链，因此被称为纳米抗体或VHH。纳米抗体体积小，一般比传统的scFv或BiTE更稳定，使其成为构建双特异性抗体的良好特性。在之前的研究中，通过将单域纳米抗体抗CEA与CD3-Fab连接构建了双特异性S-Fab抗体。S-Fab在体外表现出优异的肿瘤细胞杀伤活性(参见L.Li,P.He,C.Zhou,L.Jing,B.Dong,S.Chen,N.Zhang,Y.Liu,J.Miao,Z.Wang,Q.Li,Anovelbispecificantibody,S-Fab,inducespotentcancercellkilling,Journalofimmunotherapy,38(2015)350-356）。然而，由于缺乏恒定区(Fc)，Fab片段(包括S-Fab)由于体内快速降解而仍具有短的血浆半衰期，这使得它们不适合长期临床使用。
技术实现思路
本专利技术一方面提供一种聚乙二醇化的双特异性抗体（在本文中也称PEG-S-Fab），包含(a)抗原结合片段(Fab)，其具有轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)，以及重链可变区(VH)和部分重链恒定区(CH1)；(b)融合至所述抗原结合片段(Fab)的部分重链恒定区(CH1)的C端的单域抗原结合片段(VHH)，以及(c)融合至所述抗原结合片段(Fab)的轻链恒定区(CL)的C端的聚乙二醇(PEG)。本领域技术人员可以根据本领域常规试验操作来测试合适的PEG分子量。在一些实施方式中，所述聚乙二醇的分子量为10000至30000。在另一些实施方式中，所述聚乙二醇的分子量为20000。相应地，本专利技术提供包含所述聚乙二醇化的双特异性抗体的药物组合物，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。相应地，本专利技术提供一种宿主细胞，其包含一个或多个编码所述的双特异性抗体的多核苷酸。本专利技术另一方面提供一种工程化的双特异性抗体，包含(a)抗原结合片段(Fab)，其具有轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)，以及重链可变区(VH)和部分重链恒定区(CH1)；以及(b)融合至所述抗原结合片段(Fab)的部分重链恒定区(CH1)的C端的单域抗原结合片段(VHH)；其中所述抗原结合片段(Fab)的轻链恒定区(CL)的C端被工程化改造而具有至少一个半胱氨酸残基。相应地，本专利技术提供所述工程化的双特异性抗体在制备本专利技术的所述聚乙二醇化的双特异性抗体中的应用。本专利技术另一方面提供一种治疗癌症的方法，其包括将本专利技术所述聚乙二醇化的双特异性抗体与癌细胞接触。相应地，本专利技术提供一种治疗对象的癌症的方法，其包括将治疗有效量的本专利技术所述聚乙二醇化的双特异性抗体施用至该对象。本专利技术另一方面提供一种宿主细胞，其包含一个或多个编码上述权利要求任一项所述的双特异性抗体的多核苷酸。在一些实施方式中，所述宿主细胞是E.coli。对于多核苷酸的操作涉及分子生物学、基因工程、蛋白质工程等领域的知识和实验操作，这些都是本领域技术人员所熟知的。专利技术人在此探索了硫醇位点特异性PEG化以改善S-Fab双特异性抗体的半衰期(t1/2)。在该研究中，使用官能化的20kDa线性甲氧基PEG马来酰亚胺(MAL-PEG-OMe)缀合S-Fab。聚乙二醇化的S-Fab(PEG-S-Fab)保留了肿瘤细胞和T细胞的结合。PEG-S-Fab增强了血浆稳定性并使S-Fab的半衰期增加了12倍。PEG-S-Fab在异种移植小鼠模型中也具有更有效的肿瘤抑制效力。这些数据表明聚乙二醇化可能是增强双特异性抗体的抗肿瘤特性的有效方法。附图说明图1.来自大肠杆菌的S-Fab的表达和纯化。A.细菌S-Fab表达构建体含有pelB信号序列，抗CD3(人类UTCH1克隆)VH(或VL)和CH1(CL)以及抗CEA-VHH。为了便于抗体检测和纯化，分别在重链和轻链的C端添加flag标签和his6标签;B.共表达后S-Fab的示意图;C.两步纯化后纯化的S-Fab的考马斯蓝染色的SDS-PAGE;D，凝胶过滤分析显示S-Fab的分子量约为130kD。图2.使用20kDa线性甲氧基PEG马来酰亚胺(MAL-PEG-OMe)对双特异性S-Fab进行PEG化。以一系列PEG:S-Fab摩尔当量比(0:1、10:1、20:1、40:1和60:1)将S-Fab与官能化PEG反应并在22℃振荡2小时，然后用SDS-PAGE(5ul/样品)检查样品。A.聚乙二醇化过程中不同摩尔比的PEG:S-Fab的S-Fab的考马斯蓝染色。B.具有不同摩尔比的PEG:S-Fab的S-Fab的碘化钡复合物染料染色。C.使用抗Flag抗体检测VH-CH-CEA链的Western印迹。D.使用抗his6抗体检测VL-CL链的Western印迹。注意:0、10、20、40和60表示PEG:Fab的摩尔比的0:1、10:1、20:1、40:1和60:1。图3.PEG-S-Fab的纯化。使用凝胶过滤来分离聚乙二醇化混合物(级分1、2、3)。A.PEG-S-Fab的色谱图。B.PEG-S-Fab纯化的级分的考马斯蓝染色。C.PEG-S-Fab纯化的级分的碘化钡复合物染色。图4.PEG-S-Fab可以结合肿瘤细胞上的CEA和T细胞上的CD3+。在CEA阳性LS174T细胞(A)，CEA阴性SKOV3细胞(B)和CD3+T细胞(C)上进行使用PEG-S-Fab和S-Fab的流式细胞术分析。阳性对照抗CD3抗体OKT3用于T细胞流式细胞术。分别在LS174T细胞(上图)和SKOV3细胞(下图)中进行S-Fab(D)和PEG-S-Fab(E)的免疫荧光染色的共聚焦显微镜。比例尺代表30μm。图5.PEG-S-Fab对肿瘤细胞具有有效的特异性细胞毒性。A.使用CEA阳性LS174T细胞的细胞毒性测定。B.使用CEA阴性SKOV3细胞的细胞毒性测定。用肿瘤细胞和效应T细胞(E/T=10)孵育不同浓度的S-Fab或PEG-S-Fab。所有的数据都显示为一式三份的平均值，误差线表示SD。图6.PEG-S-Fab和S-Fab的血浆浓度的药代动力学和稳定性分析。A.定量ELISA的标准曲线。B.静脉内给药后的血清蛋白浓度-时间曲线。(注:每个数据点表示为平均值±SEM)。C-D.使用抗Flag抗体进行Western印迹以检测产生的S-Fab(C)和PEG-S-Fab(D)。E-F.使用抗h本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种聚乙二醇化的双特异性抗体，包含(a) 抗原结合片段(Fab)，其具有轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)，以及重链可变区(VH)和部分重链恒定区(CH1)；(b) 融合至所述抗原结合片段(Fab)的部分重链恒定区(CH1)的C端的单域抗原结合片段(VHH)，以及(c) 融合至所述抗原结合片段(Fab)的轻链恒定区(CL)的C端的聚乙二醇(PEG)。
【技术特征摘要】
1.一种聚乙二醇化的双特异性抗体，包含(a)抗原结合片段(Fab)，其具有轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)，以及重链可变区(VH)和部分重链恒定区(CH1)；(b)融合至所述抗原结合片段(Fab)的部分重链恒定区(CH1)的C端的单域抗原结合片段(VHH)，以及(c)融合至所述抗原结合片段(Fab)的轻链恒定区(CL)的C端的聚乙二醇(PEG)。2.根据权利要求1所述的聚乙二醇化的双特异性抗体，其中所述聚乙二醇通过所述轻链恒定区(CL)的C端的至少一个半胱氨酸残基连接至所述轻链恒定区(CL)的C端。3.根据权利要求2所述的聚乙二醇化的双特异性抗体，其中所述聚乙二醇通过所述轻链恒定区(CL)的C端具有两个半胱氨酸残基连接至所述轻链恒定区(CL)的C端时，所述两个半胱氨酸残基之间间隔有接头序列。4.根据权利要求1至3中的任一项所述的聚乙二醇化的双特异性抗体，其中所述聚乙二醇的分子量为10000至30000。5.根据权利要求4所述的聚乙二醇化的双特异性抗体，其中所述聚乙二醇的分子量为20000。6.根据权利要求1至3中的任一项所述的聚乙二醇化的双特异性抗体，其中所述抗原结合片段对肿瘤抗原具有特异性，并且所述单域抗原结合片段对免疫细胞具有特异性。7.根据权利要求6所述的聚乙二醇化的双特异性抗体，其中所述肿瘤抗原选自CEA、EGFR、Her2、EpCAM、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、CEA、gpA33、黏蛋白、TAG-72、CIX、PSMA、叶酸结合...
【专利技术属性】
技术研发人员：马梵辛，
申请(专利权)人：非同成都生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51
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