一种基于肝脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法技术

一种基于肝脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，涉及生物医药分析领域，包括以下步骤：1）将黑鲷幼鱼均分为实验组和空白组；2）在实验组的饲料中加入硒化氨基多糖；3）将实验组和空白组的黑鲷幼鱼进行饥饿处理，麻醉后，取出肝脏组织，保存备用；4）制备肝脏组织样品，同时制备质控样品，使用超高效液相色谱‑飞行时间质谱联用技术进行处理；5）收集得到的黑鲷肝脏代谢组学数据进行分析处理，识别并筛选出关于硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强的肝脏代谢组学生物标志物，并对肝脏代谢组学生物标志物指向的代谢通路进行构建和分析。本发明专利技术系统性好，准确性高，成本低，操作简单。

A construction method of immune mechanism enhancement model of Sparus macrocephalus by selenium amino polysaccharide based on metabonomics of liver

【技术实现步骤摘要】
一种基于肝脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法
本专利技术涉及生物医药分析领域，尤其涉及一种基于肝脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法。
技术介绍
硒作为机体必需微量元素，通过硒蛋白、硒依赖酶的辅助因子等形式，在机体生长和维持机体健康方面起着重要的作用。目前研究较多的是生物毒性相对较小和易于被吸收利用的有机硒，如硒化氨基多糖。硒化氨基多糖是通过化学修饰方法将多糖与无机硒结合获得，硒和多糖的生理活性和药理功能得到优化，生物活性普遍高于多糖和硒，更易于为机体吸收和利用。硒化氨基多糖可以作为增强适应性免疫性能的潜力含硒膳食补充剂。黑鲷(Acathopagrusschlegelii)是我国东南沿海地区及太平洋西岸海水养殖的经济鱼类，但关于硒化氨基多糖对黑鲷免疫调节作用的研究较少。肝脏是机体物质代谢的中枢器官，许多物质合成、分解和转化等代谢过程是在肝脏中进行。肝脏的生化变化处于基础研究与临床研究的重要交叉地位，因此，对肝脏进行代谢组学研究有着极高的基础和临床研究价值，目前关于黑鲷对硒的利用已有初步研究，但关于硒化氨基多糖对黑鲷免疫调节作用的研究较少，且现有的研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制的评价方法存在系统性差，准确性低，成本高，操作复杂等技术问题。例如，文献“不同类型硒对黑鲷幼鱼生长及血清免疫指标的影响[J].水产科学,2018(5):577-583.”，其通过对黑鲷投喂含蛋白41.57％、脂肪13.63％等氮等能基础饲料(对照组)及在其中添加2.35mg/kg硒化多糖和0.88mg/kg的亚硒酸钠(使外源硒添加量均为0.4mg/kg)的试验饲料8周，研究了不同类型的外源硒对黑鲷幼鱼生长性能、体组成和血清免疫指标的影响。且得到了添加适量的外源硒能显著提高黑鲷幼鱼的生长性能和血清免疫活性,且有机硒的生物利用率显著高于无机硒的试验结果，但该评价方法存在系统性差，准确性低，成本高，操作复杂等技术问题。
技术实现思路
本专利技术是为了克服目前现有的研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制的评价方法存在系统性差，准确性低，成本高，操作复杂等技术问题，提出了一种基于肝脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种基于肝脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，所述方法包括以下步骤：1)将用于动物实验的黑鲷幼鱼随机均分为实验组和空白组；2)采用相同的饲料饲喂实验组和空白组，并在实验组的饲料中加入硒化氨基多糖；3)饲喂结束后将实验组和空白组的黑鲷幼鱼进行饥饿处理，并用麻醉剂麻醉后，取出肝脏组织，保存备用；4)制备肝脏组织样品和质控样品，随后使用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术进行处理，进样时质控样品穿插于肝脏组织样品之间；5)对超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术所收集得到的黑鲷肝脏代谢组学数据进行分析处理，识别并筛选出关于硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强的肝脏代谢组学生物标志物，并对肝脏代谢组学生物标志物指向的代谢通路进行构建和分析。代谢组学能够将原始的反映样品信息的复杂数据经过一系列降维处理，直接反映体内生物化学过程和状态的变化，在系统研究生物内源性小分子代谢物整体和动态改变规律上具有独特优势。本专利技术结合利用高通量、高灵敏度、高分辨质谱检测技术和非靶向代谢组学方法，阐释硒化氨基多糖对黑鲷免疫调节潜在的机制和靶标途径，为黑鲷免疫增强剂的开发提供参考。作为优选，步骤1)中黑鲷幼鱼处理的具体方法为：将黑鲷幼鱼进行停饲处理，随后放入玻璃纤维缸内微流水式饲养。步骤2)中实验组和空白组饲喂具体方法为：将实验组和空白组采用普通饲料进行饲喂，并在实验组普通饲料中添加0.5～0.7mgSe/kg的硒化氨基多糖，连续饲喂8-10周。步骤3)中饲喂结束后黑鲷幼鱼处理的具体方法为：将实验组和空白组的黑鲷幼鱼饥饿20-30h后，用麻醉剂麻醉，取出肝脏组织，实验组和空白组各取数量相同的平行样，随后进行称重，并用液氮快速冷冻，最后放置于-80℃的超低温冰箱中保存，备用。步骤4)中所述肝脏组织样品制备方法为：取备用肝脏组织于离心管，加入-10～-30℃冷冻的5-15倍体积的甲醇，10000-14000rpm下均质0.5-1.5min后，在4℃下，12000-14000rpm下离心3-5min，取上清液在30-50℃下氮气吹干，并用甲醇水溶液复溶，，肝脏组织样品制备在12min内完成；质控样品制备方法为：取上述各个肝脏组织样品制备中的上清液混合均匀，在30-50℃下氮气吹干，并用甲醇水溶液复溶。步骤4)中使用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术进行处理的具体方法为：甲醇水溶液复溶肝脏组织样品经微孔滤膜过滤之后，在固定的色谱条件和质谱条件下，进入超高效液相色谱-质谱联用仪分析，并且，在检测过程中，每隔相同数量的肝脏组织样品插入一个质控样品进行检测分析，以监控检测稳定性。步骤5)中黑鲷肝脏代谢组学数据进行分析处理的具体方法为：利用XCMSplus对采集的黑鲷肝脏代谢组学数据进行全面的非靶向代谢组学分析，采用Centwave特征检测算法(峰值宽度从5到20s，质量允差为5ppm)进行峰的发现和匹配，找到有差异的生物标志物，XCMSPlus软件会自动链接到METLIN数据谱库(超过24万个代谢物信息，其中12127个代谢物有高分辨二级图谱)，并结合内源性代谢物二级谱库(包含550多个常见的内源性代谢化合物，包括分子式、分子量、CAS编号、化学名、结构图)，根据与谱库中化合物的精确一级m/z、同位素丰度比一级和二级质谱信息，鉴定得出有差异的生物标志物，并把这些生物标志物通过聚类分析，找出代谢通路。在步骤4)中，由于黑鲷肝脏中含有丰富的代谢酶，整个样品前处理过程采取低温操作，在环境温度4℃下肝脏中的代谢酶活性大大降低，保持肝脏中蛋白质、脂肪等含量相对稳定；其次，采用高速快速均质方法，目的是将肝脏样品和冷冻甲醇提取液快速充分混合，加快了甲醇提取肝脏中潜在标志物的速度；再次，采用提取液氮吹后，残渣复溶后再检测的步骤，目的是将提取液中微量的潜在标志物经过浓缩后再经超高效液相色谱-飞行时间质谱联用仪检测，增大了该类潜在标志物的检测灵敏度，客观反映了肝脏中潜在标志物；最后，由于肝脏中含有丰富的代谢酶，需要加快提取，尽量缩短提取时间，才能完整地如实体现肝脏中潜在标志物的全貌，因此，在12min内基本完成整个肝脏组织样品的制备，提取过程快速高效，即降低了人为操作带来的误差，又实现了最大限度地提取肝脏中的潜在标志物，保障了质谱数据采集和分析的准确性和精确性。作为优选，关于硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强的肝脏代谢组学生物标志物共有32个，分别为：L-组氨酸、二甲基甘氨酸、4-胍基丁酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、琥珀酸、腺嘌呤、腺苷、脱氧肌苷、肌苷、脱氧鸟苷、鸟苷、甜菜碱、L-蛋氨酸、甘油酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-丝氨酸、腺苷一磷酸、脱氧腺苷一磷酸、γ-氨基丁酸、L-谷氨酸、D-核酮糖5-磷酸、鸟苷一磷酸、鸟氨酸、L-精氨酸、肌酸、精氨基琥珀酸。作为优选，生物标志物主要指向7条代谢通路，分别为：氨酰基-tRNA生物合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于肝脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)将用于动物实验的黑鲷幼鱼随机均分为实验组和空白组；2)采用相同的饲料饲喂实验组和空白组，并在实验组的饲料中加入硒化氨基多糖；3)饲喂结束后将实验组和空白组的黑鲷幼鱼进行饥饿处理，并用麻醉剂麻醉后，取出肝脏组织，保存备用；4)制备肝脏组织样品和质控样品，随后使用超高效液相色谱‑飞行时间质谱联用技术进行处理，进样时质控样品穿插于肝脏组织样品之间；5)对超高效液相色谱‑飞行时间质谱联用技术所收集得到的黑鲷肝脏代谢组学数据进行分析处理，识别并筛选出关于硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强的肝脏代谢组学生物标志物，并对肝脏代谢组学生物标志物指向的代谢通路进行构建和分析。

【技术特征摘要】
1.一种基于肝脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)将用于动物实验的黑鲷幼鱼随机均分为实验组和空白组；2)采用相同的饲料饲喂实验组和空白组，并在实验组的饲料中加入硒化氨基多糖；3)饲喂结束后将实验组和空白组的黑鲷幼鱼进行饥饿处理，并用麻醉剂麻醉后，取出肝脏组织，保存备用；4)制备肝脏组织样品和质控样品，随后使用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术进行处理，进样时质控样品穿插于肝脏组织样品之间；5)对超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术所收集得到的黑鲷肝脏代谢组学数据进行分析处理，识别并筛选出关于硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强的肝脏代谢组学生物标志物，并对肝脏代谢组学生物标志物指向的代谢通路进行构建和分析。2.根据权利要求1所述的一种基于肝脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，其特征在于，步骤1)中黑鲷幼鱼处理的具体方法为：将黑鲷幼鱼进行停饲处理，随后放入玻璃纤维缸内微流水式饲养；步骤2)中实验组和空白组饲喂具体方法为：将实验组和空白组采用普通饲料进行饲喂，并在实验组普通饲料中添加0.5～0.7mgSe/kg的硒化氨基多糖，连续饲喂8-10周；步骤3)中饲喂结束后黑鲷幼鱼处理的具体方法为：将实验组和空白组的黑鲷幼鱼饥饿20-30h后，用麻醉剂麻醉，取出肝脏组织，实验组和空白组各取数量相同的平行样，随后进行称重，并用液氮快速冷冻，最后放置于-80℃的超低温冰箱中保存，备用；步骤4)中所述肝脏组织样品制备方法为：取备用肝脏组织于离心管，加入-10～-30℃冷冻的5-15倍体积的甲醇，10000-14000rpm下均质0.5-1.5min后，在4℃下，12000-14000rpm下离心3-5min，取上清液在30-50℃下氮气吹干，并用甲醇水溶液复溶，肝脏组织样品制备在12min内完成；质控样品制备方法为：取上述各个肝脏组织样品制备中的上清液混合均匀，在30-50℃下氮气吹干，并用甲醇水溶液复溶；步骤4)中使用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术进行处理的具体方法为：将肝脏组织样品经微孔滤膜过滤之后，在固定的色谱条件和质谱条件下，进入超高效液相色谱-质谱联用仪分析，其中，在液相色谱中C18和HILLIC两种色谱柱结合使用，并且，在检测过程中，每隔相同数量的肝脏组织样品插入一个质控样品进行检测分析，以监控检测稳定性；步骤5)中黑鲷肝脏代谢组学数据进行分析处理的具体方法为：利用XCMSplus对采集的黑鲷肝脏代谢组学数据进行全面的非靶向代谢组学分析，采用Centwave特征检测算法进行峰的发现和匹配，找到有差异的生物标志物，XCMSPlus软件会自动链接到METLIN数据谱库，并结合内源性代谢物二级谱库，根据与谱库中化合物的精确一级m/z、同位素丰度比一级和二级质谱信息，鉴定得出有差异的生物标志物，并把这些生物标志物通过聚类分析，找出代谢通路。3.根据权利要求1或2所述的一种基于肝脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，其特征在于，关于硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制...

【专利技术属性】
技术研发人员：周秀锦，张静，邵宏宏，晁铎源，宋立玲，
申请(专利权)人：舟山出入境检验检疫局综合技术服务中心，
类型：发明
国别省市：浙江,33