一种磁性固定化酶载体及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种磁性固定化酶载体及其制备方法，通过以磁性纳米颗粒Fe3O4作为基质材料，以低成本的邻苯二酚和聚胺(PCPA)二元复合物代替昂贵的多巴胺对Fe3O4载体表面进行修饰，以链状分子乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)作为柔性间隔臂连接酶和载体，获得了四氧化三铁Fe3O4‑仿多巴胺PCPA‑空间间隔臂EGDE三层结构的固定化酶载体。本发明专利技术合成的磁性纳米材料作为固定化酶载体，具有超顺磁性能、良好的生物相容性、可再生利用、分散效果好、高的酶荷载量和固定化酶活力回收等优点，适用于任何表面带丰富游离氨基的酶，是一种理想的固定化酶载体，在固定化酶领域具有巨大的应用潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种磁性固定化酶载体及其制备方法
本专利技术属于高分子材料
，尤其涉及一种磁性固定化酶载体及其制备方法。
技术介绍
酶作为一类高效的生物催化剂，具有温和的反应条件、环境友好、经济可行性、优秀的区域选择性和立体选择性等优点，因而被广泛应用于生物
但是，游离酶在大规模的实际应用中存在着一些显著的缺点，例如：酶不易回收、高成本、低稳定性等。固定化酶技术的出现为克服游离酶的上述缺点和为酶的大规模应用提供了有效途径，是酶工程最为活跃的研究领域之一。随着研究者们对纳米材料的广泛关注，许多载体材料被应用于酶的固定化研究，这些载体材料包括无机材料、天然聚合物和人工合成的聚合物。在这些材料中，磁性纳米材料作为一种无机材料，因其低毒性、超顺磁性和易于分离等优点而受到越来越多的关注。但是，酶很难直接固定在磁性材料表面，这是因为磁性纳米材料表面缺少活泼官能团，其表面的羟基和酶之间只存在弱相互作用。通过利用可降解的、生物相容性好的多聚物对磁性纳米材料表面进行功能化修饰可能是一种提高酶的固定化效率的有效策略。当今，多巴胺作为一种表面修饰剂，因其优秀的粘附能力、良好的生物相容性、丰富的活性基团而受到越来越多研究者的关注。在碱性条件下，多巴胺能够自聚、沉淀在不同基质材料表面形成聚多巴胺层，其表面丰富的醌基使得多巴胺能够和酶的氨基或者巯基发生迈克尔加成或者席夫碱反应，从而将酶固定在载体材料表面。但是，多巴胺昂贵的价格严重限制了其在工业催化领域的大规模应用的潜力。幸运的是，已有相关文献报道聚多巴胺优秀的粘附能力主要归功于邻苯二酚和氨基两个组分。因此，具有邻苯二酚和氨基结构的分子可能具有类似于多巴胺的氧化聚合能力，其氧化产物可以代替多巴胺用于酶的固定化。目前，已有文献证实了邻苯二酚/聚胺(PCPA)二元复合物系统可以用来替代多巴胺，其形成的聚合物层可以进行二次功能化，从而引入新的功能基团。此外，这个二元复合物具有显著的优势：其价格不到多巴胺价格的8％。但是，酶直接固定在仿多巴胺功能化的载体材料表面可能出现酶活损失严重的问题，这可能是由于直接固定化之后酶的空间构象改变或者底物不易进入到固定化酶的活性中心。因此，利用低毒的、链状分子作为柔性空间间隔臂连接纳米材料和酶分子是一种克服以上不足的理想策略。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于，提供一种低成本、可再生、生物相容性好的磁性固定化酶载体的制备方法。本专利技术的第二个目的在于，提供一种低成本、可再生、生物相容性好的磁性固定化酶载体。本专利技术的第三个目的在于，提供一种低成本、可再生、生物相容性好的磁性固定化酶载体的应用。为了实现本专利技术第一个目的，本专利技术提供了一种磁性固定化酶载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用溶剂热法合成Fe3O4磁性纳米颗粒；(2)将步骤(1)制备的Fe3O4纳米颗粒采用机械搅拌的方法分散在邻苯二酚和聚胺的Tris-HCl缓冲溶液中，获得仿多巴胺功能化的磁性纳米颗粒(Fe3O4-PCPANPs)；(3)将乙二醇二缩水甘油醚加入到步骤(2)的溶液中，反应产物用磁铁分离收集后用去离子水和无水乙醇洗涤，获得环氧基团功能化的磁性固定化酶载体(Fe3O4-PCPA-EGDENPs)。作为一个优选方案，步骤(2)所述聚胺为四乙烯五胺(TEPA)、三乙基四胺(TETA)和二亚乙基三胺(DETA)中的一种或几种。作为一个优选方案，步骤(2)所述邻苯二酚和聚胺的摩尔比为1:1～3:1。作为一个优选方案，步骤(2)反应时间为1-4h。作为一个优选方案，步骤(3)所述乙二醇二缩水甘油醚添加量为体积比0.5％-2.0％。作为一个优选方案，步骤(3)反应时间为2-5h。为了实现本专利技术第二个目的，本专利技术提供一种磁性固定化酶载体，利用上述磁性固定化酶载体的制备方法制备获得。为了实现本专利技术第三个目的，本专利技术提供磁性固定化酶载体在制备酶-前药疗法药物中的应用，以及磁性固定化酶载体在制备手性药物中的应用。本专利技术的原理(参见图1)：本专利技术以具有快速磁响应的Fe3O4为载体材料，利用邻苯二酚(Catechol)/聚胺二元复合物(CPA)在弱碱性条件下(pH8.5)发生氧化聚合反应，形成仿多巴胺的PCPA层。仿多巴胺分子CPA中的邻苯二酚基团的羟基能够与铁原子形成配位键，其作用力非常大，使得仿多巴胺分子能够紧紧的包裹在Fe3O4纳米颗粒表面，形成仿多巴胺改性的Fe3O4纳米微球。此外，乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)和上述材料发生开环反应对磁性仿多巴胺纳米颗粒进行二次功能化，获得环氧基团功能化的柔性固定化酶载体-载酶四氧化三铁Fe3O4-仿多巴胺PCPA-空间间隔臂EGDE三层结构的纳米颗粒。环氧基团功能化的载体能够和酶的氨基之间发生开环反应，从而实现酶的柔性固定。本专利技术所指的酶是表面具有丰富游离氨基基团的酶。本专利技术的优点在于，(1)本专利技术使用简单的仿生粘合技术，首次合成了磁性固定化酶载体Fe3O4-PCPA-EGDE，并用于酶的固定化。该磁性载体材料耦合了仿多巴胺化合物PCPA的粘附能力以及空间间隔臂EGDE表面高密度环氧基团于一体，有效提高了固定化酶的活性和重复利用能力。(2)本专利技术利用具有类似多巴胺的粘附能力的特征且具有良好生物相容性和价格低廉的邻苯二酚/聚胺的二元复合物，对载体材料进行修饰，成本低廉有利于固定化酶的工业化应用。(3)本专利技术合成的磁性纳米材料通过透射电镜、红外光谱、TGA、磁滞曲线、XRD等数据对其形貌结构进行表征。合成的材料结果符合实验最初的设计，所得材料具有良好的分散性、超顺磁性利于回收、饱和磁强度为56.33emu/g。其表面有丰富的环氧基团使其成为理想的酶的固定化载体材料。(4)本专利技术测定了固定化脂肪酶的性能。固定化脂肪酶的最适pH为7.0；最适温度为40℃；贮存5周后，固定化脂肪酶的剩余相对活力超过75％，远高于游离酶；9次催化反应后，剩余相对酶活力为76.4％。相比于游离酶，固定化脂肪酶对催化环境的条件耐受性增强。pH稳定性、温度稳定性、贮存稳定性、重复利用性都显著提高。因此，本专利技术获得的磁性纳米颗粒是一种理想的固定化酶载体，在固定化酶领域具有巨大的应用潜力。(5)本专利技术的固定化方法，能够用于脂肪酶等一系列含有丰富游离氨基基团的酶的固定化。本专利技术提出了一种新型的简单的低成本的固定化酶策略并成功构建了表面功能化的Fe3O4-PCPA-EGDE磁性纳米复合物。主要通过以磁性纳米颗粒Fe3O4作为基质材料，以低成本的邻苯二酚/聚胺(PCPA)二元复合物代替昂贵的多巴胺对Fe3O4载体表面进行修饰，以链状分子乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)作为柔性间隔臂连接酶和载体，实现酶的柔性固定化，获得了四氧化三铁Fe3O4-仿多巴胺PCPA-空间间隔臂EGDE-酶enzyme四层结构的固定化酶。获得的复合物载体具有磁响应性、良好的生物相容性、可再生利用、分散效果好、高的酶荷载量等优点，是一种理想的固定化酶载体，在固定化酶领域具有巨大的应用潜力。附图说明图1：本专利技术制备方法基本原理图。图2：制备的磁性Fe3O4纳米粒子的透射电镜图。其中，(a)、(b)为修饰前的Fe3O4透射电镜图(Fe3O4)。(c)、(d)为修饰后的Fe3O4透射电镜图(Fe3O4-PCPA)。图3：制备本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种磁性固定化酶载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用溶剂热法合成Fe3O4磁性纳米颗粒；(2)将步骤(1)制备的Fe3O4纳米颗粒采用机械搅拌的方法分散在邻苯二酚和聚胺的Tris‑HCl缓冲溶液中，获得仿多巴胺功能化的磁性纳米颗粒；(3)将乙二醇二缩水甘油醚加入到步骤(2)的溶液中，反应产物用磁铁分离收集后用去离子水和无水乙醇洗涤，获得环氧基团功能化的磁性固定化酶载体。

【技术特征摘要】
1.一种磁性固定化酶载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用溶剂热法合成Fe3O4磁性纳米颗粒；(2)将步骤(1)制备的Fe3O4纳米颗粒采用机械搅拌的方法分散在邻苯二酚和聚胺的Tris-HCl缓冲溶液中，获得仿多巴胺功能化的磁性纳米颗粒；(3)将乙二醇二缩水甘油醚加入到步骤(2)的溶液中，反应产物用磁铁分离收集后用去离子水和无水乙醇洗涤，获得环氧基团功能化的磁性固定化酶载体。2.根据权利要求1所述的一种磁性固定化酶载体的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述聚胺为四乙烯五胺、三乙基四胺和二亚乙基三胺中的一种或几种。3.根据权利要求1所述的一种磁性固定化酶载体的制备方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈超，汤文，王平，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海,31