一种耐高温α-鼠李糖苷酶基因及其转化芦丁生成异槲皮素方面的应用制造技术

本发明专利技术所述耐热α‑鼠李糖苷酶能够高效地转化芦丁生成异槲皮素，本发明专利技术所述耐热α‑鼠李糖苷酶具有优良的热稳定性；本发明专利技术所述α‑鼠李糖苷酶与芦丁在适宜条件下孵育后能够几乎实现完全转化，获得活性更强的异槲皮素。

【技术实现步骤摘要】
一种耐高温α-鼠李糖苷酶基因及其转化芦丁生成异槲皮素方面的应用
本专利技术属于基因工程技术及生物医药领域，具体涉及一种α-鼠李糖苷酶及其转化芦丁制备异槲皮素方面的应用。
技术介绍
芦丁是一种常见的黄酮类化合物，广泛存在于中草药、水果、蔬菜以及许多植物衍生中。它具有抗氧化，抗高血糖和神经保护作用等多种生物活性。研究表明，芦丁与它的去鼠李糖基产物异槲皮素(槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷)和去芸香糖基产物槲皮素相比，虽然母核的黄酮结构完全相同，仅糖基种类和数量存一定差异，但三者的生物活性具有显著的差异。其中异槲皮素与芦丁及槲皮素相比在活性方面具有的显著的优势：1.异槲皮素具有更好的生物利用度。相比芦丁和苷元槲皮素能够更好地被吸收，连接单一的葡萄糖基能够提供合适的极性，有利于提高小肠上皮细胞对其吸收的效率；2.异槲皮素对恶性肿瘤具有更强的抗增殖作用，对HIV-1和HSV-1/2的活性具有更好的抑制作用，在清除自由基对损伤细胞的保护作用也优于芦丁，同时相对槲皮素能更有效地对乙酰胆碱酯酶活性，因此异槲皮素在抗肿瘤、抗病毒、抗氧化以及抗老年痴呆症等方面具有深入开发的价值。此外，异槲皮素与其α-糖苷衍生物是目前唯一被美国FDA批准的的黄酮类食品添加剂。但异槲皮素与许多特殊的生物活性成分一样，其在自然界的含量很低，难以提取分离进行大规模制备。因此，一种高效制备异槲皮素的方法对其广泛的应用具有重要意义。根据目前的研究发现，槲皮素的芸香糖苷(芦丁)在多种植物的提取物，如银杏叶和槐米中，占有较高的含量，使得对其提取和分离相对容易，且成本较低。同时芦丁与异槲皮素两者之间仅相差一个鼠李糖，通过有效的手段选择性地切除芦丁上的鼠李糖残基将易于获得低含量高附加值产物异槲皮素。生物酶法因其选择性强副产物少、转化率高以及反应条件温和等优点逐渐被应用于天然产物的改性增效。α-L-鼠李糖苷酶是一种能够水解末端非还原鼠李糖残基的一种糖苷水解酶，虽然目前已有研究和相关专利中，报道了少部分微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶能够选择性转化芦丁生成异槲皮素，但是由于芦丁的溶解度受溶液的温度和反应体系反应显著，20℃冷水中溶解度为0.012％，但低温或者常温条件下的鼠李糖苷酶热稳定性不强，无法耐受高底物浓度转化体系所需的温度，因为发掘热稳定性较强的能够同时能够高效转化芦丁生成异槲皮素的α-L-鼠李糖苷酶尤为重要。
技术实现思路
解决的技术问题：针对目前酶转化芦丁制备异槲皮素存在的问题，本专利提供了一种热稳定性较强同时能够高效切除芦丁鼠李糖基的α-鼠李糖苷酶基因，并通过基因工程技术获得催化性能稳定，成分单一的重组α-鼠李糖苷酶MTHRHA，能够有效地通过酶催化转化芦丁获得异槲皮素。技术方案：一种α-鼠李糖苷酶，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。编码所述α-鼠李糖苷酶的核苷酸，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。所述α-鼠李糖苷酶的制备方法，将SEQIDNO.2所示的DNA片段插入表达载体获得重组质粒，将重组质粒转化宿主菌，以及其诱导表达条件和后续目的蛋白的纯化。所述制备方法步骤如下：1)、以提取的M.thermophilaATCC42464基因组DNA为模板，根据毕赤酵母密码子偏好性对基因片段进行改造并合成得到SEQIDNO.2所示的DNA分子；2)、用具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列的下游引物扩增，PCR扩增得到的DNA分子和pPICZαA分别用EcoRI和XbaI进行双酶切，连接得到含有所述的α-鼠李糖苷酶的核苷酸序列的重组质粒；3)、将步骤2)得到的重组质粒进行线性化后转化到表达毕赤酵母GS115感受态细胞中，阳性转化子于28℃培养，添加0.8％甲醇诱导基因表达，待产酶阶段结束离心收集上清液，即为所需酶蛋白。所述α-鼠李糖苷酶在转化芦丁制备异槲皮素等糖苷类天然产物改性增效方面的应用。一种通过所述α-鼠李糖苷酶转化转化芦丁制备异槲皮素的方法，所述α-鼠李糖苷酶在pH4-8，温度40℃-80℃。pH优选为6.0，温度优选为70℃。有益效果：(1)本专利技术所述耐高温α-鼠李糖苷酶能够长时间耐受高温，热稳定性优异；(2)本专利技术所述α-鼠李糖苷酶对芦丁等黄酮糖苷类化合物转化能力强，能够广泛应用于糖苷类天然产物的选择性酶法改性增效；附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为本专利技术所述α-鼠李糖苷酶芦丁制备异槲皮素的水解线路图。图2为实施例3本专利技术所述α-鼠李糖苷酶诱导表达结果图，其中a图为不同诱导剂浓度下酶活力的影响，其中b图诱导温度对酶活力表达的影响。图3为实施例4本专利技术所述α-鼠李糖苷酶的定性测定结果图，其中a图为最适反应温度的测定结果图，横坐标为温度，单位摄氏度(℃)，纵坐标为相对酶活力，单位％；b图为最适反应pH的测定结果图，横坐标为pH，纵坐标为相对酶活力，单位％；c图为pH稳定性的测定结果图，横坐标为pH，纵坐标为相对酶活力，单位％；d图为温度稳定性的测定结果图，横坐标为保温时间，单位分钟(min)，纵坐标为相对酶活力，单位％。图4为实施例5本专利技术本专利技术所述α-鼠李糖苷酶转化芦丁的条件测定结果图，其中图a为酶转化芦丁的最适pH测定结果图，横坐标为pH，纵坐标为芦丁转化率测定结果图，单位％；图b为酶转化芦丁的最适温度测定结果图，横坐标为温度，单位摄氏度(℃)，纵坐标为芦丁转化率，单位％；c图为酶转化芦丁的酶用量测定结果图，横坐标为用酶量，单位摄氏度(℃)，纵坐标为芦丁转化率，单位％。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅为本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术提供了一种优良耐热性能的α-鼠李糖苷酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，命名为MTHRHA。本专利技术也提供了编码本专利技术所述α-鼠李糖苷酶的DNA分子片段。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本专利技术所述的α-鼠李糖苷酶的核苷酸序列。在一些实施方案中，本专利技术提供了可以编码所述的α-鼠李糖苷酶MTHRHA的DNA分子，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术提供了一种包含本专利技术所述的α-鼠李糖苷酶的DNA分子的重组质粒，所述的重组质粒为pPICZαA-MTHRHA。本专利技术所述转化表达宿主菌为毕赤酵母表达菌株，包括GS115和KM71、X33系列菌株。在一个优选实施方案中，宿主细胞为GS115菌株。本专利技术所述α-鼠李糖苷酶的制备方法所述诱导表达具体为BMMY培养含MTHRHA基因的重组菌，待产酶阶段结束收集上清液即可获得所需目的酶蛋白。本专利技术还提供了一种酶法转化芦丁制备异槲皮素的方法，具体为本专利技术所述α-鼠李糖苷酶在下pH5.5，70℃条件下可酶解芦丁制备得到异槲皮素。为了进一步理解本专利技术，下面结合实施例对本专利技术进行详细阐述，其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到；如无特殊说明，实施例中涉及的具体操作参见《分子克隆实验指南第三版》。实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种α‑鼠李糖苷酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种α-鼠李糖苷酶，其特征在于氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.编码权利要求1所述α-鼠李糖苷酶的核苷酸，其特征在于核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.权利要求1所述α-鼠李糖苷酶的制备方法，其特征在于将SEQIDNO.2所示的DNA片段插入表达载体获得重组质粒，将重组质粒转化宿主菌，以及其诱导表达条件和后续目的蛋白的纯化。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：解静聪，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院林产化学工业研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32