一种利用固定化漆酶催化降解异黄酮的方法技术

本发明专利技术提供一种利用固定化漆酶催化降解异黄酮的方法，以来源于一色齿毛菌（Cerrena unicolor）HYB07菌株的漆酶为对象，采用丙烯酰基改性磁性微球Fe3O4‑SiO2‑MPS为载体对漆酶进行固定化，利用固定化漆酶降解大豆异黄酮。本发明专利技术采用丙烯酰基改性磁性微球Fe3O4‑SiO2‑MPS为载体固定漆酶，改善漆酶的酶学性质；利用固定化漆酶高效降解大豆异黄酮，实现漆酶在异黄酮类环境激素降解中的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种利用固定化漆酶催化降解异黄酮的方法
本专利技术涉及一种利用固定化漆酶催化降解异黄酮的方法，属于生物工程领域。以来源于一色齿毛菌（Cerrenaunicolor）HYB07菌株的漆酶为对象，采用丙烯酰基改性磁性微球Fe3O4-SiO2-MPS为载体对漆酶进行固定化，利用固定化漆酶催化降解异黄酮化合物。
技术介绍
漆酶作为高效多酚氧化酶，可作用于多种底物，并在催化酚或芳香胺等化合物时进行单电子传递形成低聚物，同时将氧分子还原成水分子。但由于游离酶利用率低，不可回收，成本高，限制了工业化应用。磁性纳米粒子具有表面积大和高质量转移等特殊性质，可通过施加外部磁场对其分离进行回收，因此磁性纳米粒子作为多功能载体受到了广泛的关注。本专利技术采用丙烯酰基改性磁性微球Fe3O4-SiO2-MPS为载体对漆酶进行固定化。异黄酮是天然存在的黄酮类化合物，主要以二酚化合物形式存在，属于植物激素，作用方式与微量雌激素相同，其中环B和C之间的连接赋予它们特定的应用及生物化学修饰（乙酰化和丙酰化）。通常摄入大豆食品中的异黄酮，经肠-葡萄糖苷酶水解后，以糖苷形式与糖结合，并释放出具有生物活性的糖苷配基，这些糖苷配基可以在肠道中被吸收或进一步代谢成几种特定的代谢物。这种代谢的程度在个体之间差异很大，受肠道菌群的组成和活性以及饮食中的碳水化合物丰富程度的影响。本专利技术采用丙烯酰基改性磁性微球Fe3O4-SiO2-MPS为载体固定漆酶，改善漆酶的酶学性质；利用固定化漆酶高效降解大豆异黄酮，实现漆酶在异黄酮类环境激素降解中的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用固定化漆酶催化降解异黄酮的方法，以来源于一色齿毛菌（Cerrenaunicolor）HYB07菌株的漆酶为对象，采用丙烯酰基改性磁性微球Fe3O4-SiO2-MPS为载体对漆酶进行固定化，利用固定化漆酶催化降解异黄酮类化合物，建立固定化漆酶催化降解异黄酮的工艺条件。为实现上述目的，采用以下技术方案：所述方法包括如下步骤：（1）固定化漆酶的制备：漆酶由Cerrenasp.HYB07发酵制得，采用水热法合成磁微粒Fe3O4，以溶胶凝胶法在磁微粒表面包裹一层SiO2，制备磁性二氧化硅微球Fe3O4-SiO2，再用丙烯酰基硅烷偶联剂MPS对Fe3O4-SiO2进行表面修饰，制得丙烯酰基改性磁性微球Fe3O4-SiO2-MPS；采用金属离子螯合法，称取1gFe3O4-SiO2-MPS加入到500mL0.01mol/L的CuCl2溶液中搅拌8h，磁铁分离去上清，去离子水洗涤数次，加入到20mLpH3.0PBS缓冲体系中，加入总酶量为150U的漆酶，搅拌超声分散，放入200r/min20℃摇床固定5h，磁分离去上清，蒸馏水清洗3次，收集固定化漆酶；（2）固定化漆酶催化降解大豆异黄酮：大豆异黄酮在反应体系为20mL的B-R缓冲液中进行酶解，底物浓度为20mg/L，加入漆酶，调节溶液pH为2.0-6.0，然后放置在水浴摇床在20-60℃下反应1-60min，即完成大豆异黄酮的降解步骤；（3）大豆异黄酮酶解产物ESI-MS分析：质谱条件为负电子喷射电离模式（ESI-）下操作，使用氮气作为去溶剂化气体并保持10L/min的流速，去溶剂化温度设定在350℃，碎片设定为90V。基于ESI-MS片段模式分析，推测漆酶降解大豆异黄酮的产物为雌马酚。固定化漆酶催化降解大豆异黄酮的工艺条件为：大豆异黄酮浓度20mg/L，加酶量4U/mL，pH4.0，温度40℃，转速80r/min，降解20min，大豆异黄酮的转化率为96%。本专利技术的优点在于：漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，可作用于多种底物，在环境激素降解中具有很好的应用潜力。本专利技术采用固定化漆酶高效降解异黄酮；同时通过对漆酶的固定化，显著提高了漆酶的操作稳定性和循环使用次数，克服了游离酶易失活变性、不能重复利用的缺点，降低了工业化应用成本。附图说明图1：Fe3O4（A）和Fe3O4-SiO2-MPS（B）合成示意图。图2：Fe3O4-SiO2-MPS分散性（A）和磁响应性（B）示意图。图3：Fe3O4和Fe3O4-SiO2-MPS的红外光谱图。图4：游离酶和固定化酶的最适反应pH。图5：游离酶和固定化酶的最适反应温度。图6：游离酶和固定化酶的pH稳定性。图7：固定化酶的操作稳定性。图8：游离酶和固定化酶的储存稳定性。图9：染料木黄酮的ESI-MS质谱分析图。图10：黄豆苷元的ESI-MS质谱分析图。图11：大豆异黄酮降解产物的ESI-MS质谱分析图。具体实施方式实施例1固定化漆酶的制备（1）磁源微粒的制备分别称取10.125gFeCl3·6H2O和27gCH3COONa，加入到300mL乙二醇溶液中，超声5min至溶解，再加入7.5mLPEG40000饱和溶液，磁力搅拌15min，将反应混合液转至三口烧瓶中，使用电热套（180˚C）进行冷凝回流反应8h，待冷却至室温后，用磁铁分离出磁源微球（Fe3O4），用无水乙醇洗涤数次，50˚C烘干保存备用。（2）磁性二氧化硅微球的制备称取1g已制备的Fe3O4，加入到400mL80%乙醇溶液中，超声1h，向反应液中加入12mL浓氨水，室温搅拌15min，再加入4mLTEOS继续搅拌4h，用磁铁分离制得的磁性二氧化硅微球（Fe3O4-SiO2），分别用无水乙醇和去离子水洗涤数次，50˚C烘干保存备用。（3）改性磁性二氧化硅微球的制备称取1gFe3O4-SiO2超声分散于1000mLTris-HCl缓冲液（pH8.2）中，随后转移至烧杯中，缓慢加入7.5mLMPS以及7.5mLTEOS，在室温下电动搅拌(350r/min)反应16h，用磁铁分离收集得到丙烯酰基改性磁性微球（Fe3O4-SiO2-MPS），用去离子水洗涤数次，50℃烘干保存备用。称取1g上述所制得的Fe3O4-SiO2-MPS，加入到500mL0.01mol/L的CuCl2溶液中，随后搅拌8h进行Cu2+螯合吸附。磁铁分离去上清，用去离子水洗涤数次，加入到20mLPBS（pH3.0）缓冲体系中，加入总酶量为150U的漆酶，超声分散，放入20℃摇床（200r/min）固定5h，磁分离去上清，蒸馏水清洗数次，收集固定化漆酶。结果如图1所示，图1A为Fe3O4制备的成品，Fe3O4为黑色，成粉末颗粒状；图1B为Fe3O4-SiO2-MPS的成品，颜色为褐色，表面比较松软，说明Fe3O4已被改性成Fe3O4-SiO2-MPS。图2A将制备好的Fe3O4-SiO2-MPS分散于蒸馏水中，微球在10秒内快速移动到磁体的一边（图2B），并且一旦磁体被移除，微粒就会再次恢复到图2A的分散状态，这表明Fe3O4-SiO2-MPS具有优异的再分散性和磁响应性。采用傅里叶转换红外光谱，对制得的样品结构进行表征分析，如图3显示，在波数590cm-1处出现Fe-O的特征吸收峰，在波数3372cm-1处出现对应于SiO2中Si-OH的特征吸收峰，此外，在806cm-1为Si-O-Fe的特征吸收峰，说明Fe3O4被成功包裹在SiO2层内；在1094cm-1处出现了C-O-C(醚基)的特征吸收峰，表明丙烯酰基附着在二氧化硅的表面，Fe3O4-SiO2被成功改性为Fe3O4-SiO2-MP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用固定化漆酶催化降解异黄酮的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：（1）固定化漆酶的制备：漆酶由

【技术特征摘要】
1.一种利用固定化漆酶催化降解异黄酮的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：（1）固定化漆酶的制备：漆酶由Cerrenasp.HYB07发酵制得，采用水热法合成磁微粒Fe3O4，以溶胶凝胶法在磁微粒表面包裹一层SiO2，制备磁性二氧化硅微球Fe3O4-SiO2，再用丙烯酰基硅烷偶联剂MPS对Fe3O4-SiO2进行表面修饰，制得丙烯酰基改性磁性微球Fe3O4-SiO2-MPS；采用金属离子螯合法，称取1gFe3O4-SiO2-MPS加入到500mL0.01mol/L的CuCl2溶液中搅拌8h，磁铁分离去上清，去离子水洗涤数次，加入到20mLpH3.0PBS缓冲体系中，加入总酶量为150U的漆酶，搅拌超声分散，放入200r/min20℃摇床固定5h，磁分离去上...

【专利技术属性】
技术研发人员：林娟，李制华，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建,35