用于肌肉萎缩症的外显子跳跃寡聚体缀合物制造技术

描述了与人抗肌肉萎缩蛋白基因中选定的靶位点互补以诱导外显子45跳跃的反义寡聚体缀合物。

Exon hopping oligomer conjugate for muscular dystrophy

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于肌肉萎缩症的外显子跳跃寡聚体缀合物相关信息本专利申请要求于2016年12月19日提交的美国临时专利申请序列号62/436,199、2017年1月6日提交的美国临时专利申请序列号62/443,481、2017年3月30日提交的美国临时专利申请序列号62/479,177和2017年9月22日提交的美国临时专利申请序列号62/562,119的权益。上述临时专利申请的全部内容通过引用并入本文。
本公开涉及适用于人抗肌萎缩蛋白基因的外显子45跳跃的新型反义寡聚体缀合物及其药物组合物。本公开还提供了使用该新型反义寡聚体缀合物诱导外显子45跳跃的方法，在具有适合于外显子45跳跃的抗肌萎缩蛋白基因突变的受试者中产生抗肌萎缩蛋白的方法，以及治疗具有适合外显子45跳跃的抗肌萎缩蛋白基因突变的受试者的方法。
技术介绍
正在开发反义技术，使用一系列化学物质来影响各种不同水平的基因表达(转录，剪接，稳定性，翻译)。大部分研究都集中在使用反义化合物来纠正或补偿各种适应症中的异常或疾病相关基因。反义分子能够以特异性抑制基因表达，因此，许多关于寡聚体作为基因表达调节剂的研究工作集中于抑制靶基因的表达或顺式作用元件的功能。反义寡聚体通常针对RNA，或有义链(例如mRNA)，或在一些病毒RNA靶标的情况下为负链。为了实现特定基因下调的期望效果，寡聚体通常促进靶mRNA的衰变，阻断mRNA的翻译或阻断顺式作用RNA元件的功能，从而有效地防止靶蛋白的从头合成或病毒RNA的复制。然而，当目的是上调天然蛋白质的产生或补偿诱导翻译过早终止的突变(例如无义或移码突变)时，这些技术是无用的。在这些情况下，缺陷基因转录物不应进行靶向降解或空间抑制，因此反义寡聚体化学不应促进靶mRNA衰变或阻断翻译。在各种遗传疾病中，突变对基因最终表达的影响可以通过在剪接过程中靶向外显子跳跃的过程来调节。剪接过程由复杂的多组分机制引导，其使前mRNA中的相邻外显子-内含子连接点紧密接近，并在内含子的末端进行磷酸二酯键的切割，随后在待拼接在一起的外显子之间进行重组。这种复杂且高度精确的过程由前mRNA中的序列基序介导，所述序列基序是相对较短的半保守RNA区段，其随后参与剪接反应的各种核剪接因子结合。通过改变剪接机器读取或识别前mRNA加工中涉及的基序的方式，可以产生差异剪接的mRNA分子。现在已经认识到，在正常基因表达期间，大多数人类基因是可变剪接的，尽管尚未鉴定出所涉及的机制。Bennett等人(美国专利号6,210,892)描述了使用不诱导RNA酶H介导的靶RNA切割的反义寡聚体类似物对野生型细胞mRNA加工的反义调节。这可用于产生缺少特异性外显子的可变剪接mRNA(参见例如，如Sazani，Kole等人，2007所述，用于产生缺乏编码跨膜结构域的外显子的可溶性TNF超家族受体)。如果正常功能蛋白由于其中的突变而过早终止，通过反义技术恢复某些功能性蛋白质生产的方法已被证明可以通过在剪接过程中进行干预，并且如果与引起疾病的突变有关的外显子可以从某些基因中特异性地删除，有时可以产生缩短的蛋白质产物，其具有与天然蛋白质相似的生物学特性或具有足够的生物活性以改善由与外显子相关的突变引起的疾病(参见例如Sierakowska，Sambade等人1996；Wilton，Lloyd等人，1999；vanDeutekom，Bremmer-Bout等人，2001；Lu，Mann等人，2003；Aartsma-Rus，Janson等人，2004)。Kole等人(美国专利号5,627,274；5,916,808；5,976,879和5,665,593)公开了使用不促进靶向前mRNA的衰变的修饰的反义寡聚体类似物来对抗异常剪接的方法。Bennett等人(美国专利号6,210,892)描述了野生型细胞mRNA加工的反义调节，其也使用不诱导RNA酶H介导的靶RNA切割的反义寡聚体类似物。靶向外显子跳跃的过程可能在其中存在许多外显子和内含子、其中外显子的遗传构成存在冗余或者其中蛋白质能够在没有一个或多个特定外显子的情况下起作用的长基因中特别有用。为了治疗与各种基因突变引起的截短相关的遗传疾病，重新定向基因加工的努力集中在使用反义寡聚体，其中：(1)与剪接过程中涉及的元件完全或部分重叠；或者(2)在足够接近该元件的位置与前mRNA结合，以破坏通常介导在该元件处发生的特定剪接反应的剪接因子的结合和功能。Duchenne肌肉萎缩症(DMD)由蛋白质抗肌萎缩蛋白的表达缺陷引起。编码该蛋白质的基因含有79个外显子，分布在超过200万个DNA核苷酸上。改变外显子的阅读框架、或引入终止密码子、或特征在于删除整个框外外显子或外显子或者重复一个或多个外显子的任何外显子突变有可能破坏功能性抗肌萎缩蛋白的产生，导致DMD。Becker肌肉萎缩症(BMD)是一种不太严重的肌肉萎缩症，它已被发现其中突变通常是一个或多个外显子的缺失，导致沿整个抗肌肉萎缩蛋白转录的正确阅读框架，从而将mRNA翻译为蛋白质不会过早终止。如果在突变的抗肌肉萎缩蛋白前mRNA的加工中上游和下游外显子的连接保持基因的正确阅读框架，则结果是编码具有短内部缺失的蛋白质的mRNA，其保留一些活性，导致Becker表型。多年来，已知不改变抗肌肉萎缩蛋白的阅读框架的一个或多个外显子的缺失将产生BMD表型，而引起移码的外显子缺失将产生DMD(Monaco，Bertelson等，1988)。通常，抗肌肉萎缩蛋白突变包括点突变和外显子缺失，其改变阅读框架并因此中断正确的蛋白质翻译导致DMD。还应注意，一些BMD和DMD患者具有覆盖多个外显子的外显子缺失。已经在体外和体内报道了用反义寡核糖核苷酸调节突变型抗肌肉萎缩蛋白前mRNA剪接(参见例如Matsuo，Masumura等人1991；Takeshima，Nishio等人1995；Pramono，Takeshima等人1996；Dunckley，Eperon等人1997；Dunckley，Manoharan等人1998；Wilton，Lloyd等人1999；Mann，Honeyman等人2002；Errington，Mann等人2003)。反义寡聚体已被专门设计用于靶向前mRNA的特定区域，通常是外显子，以诱导DMD基因突变的跳跃，从而框内恢复这些框外突变，从而使内部缩短但功能性的抗肌肉萎缩蛋白产生。已知这种反义寡聚体靶向完全在外显子(所谓的外显子内部序列)内或在剪接供体或剪接受体连接处，其从外显子穿过进入内含子的一部分。这种用于DMD的反义寡聚体的发现和开发已成为先前研究的领域。这些发展包括以下那些：(1)西澳大利亚大学和SareptaTherapeutics(本申请的受让人)：WO2006/000057；WO2010/048586；WO2011/057350；WO2014/100714；WO2014/153240；WO2014/153220；(2)AcademischZiekenhuisLeiden/ProsensaTechnologies(现为BioMarinPharmaceutical)：WO02/24906；WO2004/083432；WO2004/083446；WO2006/11270本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种式(I)的反义寡聚体缀合物：

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.19 US 62/436199;2017.01.06 US 62/443481;201.一种式(I)的反义寡聚体缀合物：或其药学上可接受的盐，其中：每个Nu是核碱基，它们一起形成靶向序列；并且T是选自以下的部分：其中，R1是C1-C6烷基；其中，所述靶向序列与抗肌肉萎缩蛋白前mRNA中的外显子45退火位点互补，所述退火位点被指定为H45A(-03+19)。2.根据权利要求1所述的反义寡聚体缀合物，其中，每个Nu独立地选自胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)、5-甲基胞嘧啶(5mC)、尿嘧啶(U)和次黄嘌呤(I)。3.根据权利要求1所述的反义寡聚体缀合物，其中，所述靶向序列是SEQIDNO：1(5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3')，其中，胸腺嘧啶(T)任选地是尿嘧啶(U)。4.根据权利要求1所述的反义寡聚体缀合物，其中，T是并且所述靶向序列是SEQIDNO：1(5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3')，其中，胸腺嘧啶(T)任选地是尿嘧啶(U)。5.根据权利要求1所述的反义寡聚体缀合物，其中，T是并且所述靶向序列是SEQIDNO：1(5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3')。6.一种式(II)的反义寡聚体缀合物：或其药学上可接受的盐，其中，从1至22以及5'至3'的每个Nu是(SEQIDNO：1)：并且其中，A是C是G是并且每个X是7.根据权利要求6所述的反义寡聚体缀合物，其中，每个X是8.根据权利要求6所述的反义寡聚体缀合物，其中，所述反义寡聚体是式(IIA)：其中，从1至22以及5'至3'的每个Nu是(SEQIDNO：1)：并且其中，A是C是G是并且每个X是9.根据权利要求6所述的反义寡聚体缀合物，其中，每个X是10.一种式(IV)的反义寡聚体缀合物：或其药学上可接受的盐。11.根据权利要求9所述的反义寡聚体缀合物，其中，所述反义寡聚体是式(IVA)：12.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的反义寡...

【专利技术属性】
技术研发人员：MA帕西尼，GJ汉森，
申请(专利权)人：萨勒普塔医疗公司，
类型：发明
国别省市：美国,US