一种NTRK融合基因的检测方法、试剂盒以及探针库技术

本发明专利技术开发了基于杂交选择而捕获特定NTRK融合基因序列的方法，采用该方法可以获得成几千倍富集的NTRK融合基因DNA片段，该经富集的NTRK融合基因片段样本可以选择性地应用于各种基因检测技术，特别是可以应用下一代测序技术进行基因突变、缺失、增加、和颠换等方面的检测，以取得高效且准确的结果。

Detection method, kit and probe library of ntrk fusion gene

【技术实现步骤摘要】
一种NTRK融合基因的检测方法、试剂盒以及探针库
本专利技术涉及一种NTRK融合基因的检测方法、试剂盒以及探针库，属于基因测序

技术介绍
神经营养受体酪氨酸激酶(NeurotrophicReceptorTyrosineKinase,NTRK)基因NTRK1、NTRK2和NTRK3分别编码原肌球蛋白受体激酶(TropomyosinReceptorKinase,TRK)家族的三种蛋白TRKA、TRKB和TRKC，这些蛋白通常在神经元组织中表达，促进神经细胞发育。这三种蛋白很少在神经组织外表达，但是NTRK基因融合导致的3个TRK受体结构激活被认为是泛癌种的致癌因素。NTRK基因融合(NTRK基因家族成员NTRK1、NTRK2、NTRK3与另一个不相关基因融合)是一类导致嵌合TRK融合蛋白持续激活的基因变异，在多种实体肿瘤中有检测到此类融合，发生此类基因融合的肿瘤细胞，其融合蛋白可作为致癌驱动因子促进肿瘤细胞的增殖和存活。TRK家族蛋白是酪氨酸激酶，如果能抑制激酶活性，就能抑制癌症生长。目前NTRK抑制剂Larotrectinib已获得FDA批准上市，针对NTRK融合的晚期实体瘤患者，这也是第一个泛癌种靶向药物，不限癌种，只针对特定基因变异。FDA批准Larotrectinib是基于3个多中心研究合并数据(LOXO-TRK-14001、SCOUT和NAVIGATE)，分别使用高通量测序技术(NextGenerationSequencing，NGS)和FISH进行NTRK基因状态的检测，总缓解率ORR达75％，其中22％的患者完全缓解，53％的患者部分缓解。据统计，NTRK基因融合在成人肿瘤和儿童肿瘤中均有发生，发生频率分别约为0.31％和0.34％，其中常见癌症类型如软组织肉瘤、唾液腺癌、肺癌、甲状腺癌、结肠癌、婴儿纤维肉瘤、黑色素瘤等等。2018年ESMO大会上公布的一项研究发现大约0.3％的中国实体瘤患者中存在NTRK基因融合，且NTRK基因融合更常见于非小细胞肺癌(0.3％)和结直肠癌(1.4％)。2018年中国肿瘤学大会上，世和基因汪笑男博士公布了一项中国实体瘤大样本统计数据，数据显示NTRK1基因融合的伴侣基因非常多样，其中TPM3基因占21％，基因间隔区占20％，IRF2BP2基因占13％、LMNA基因占13％，TPR基因占13％等。基于NGS检测NTRK融合相比于FISH等传统检测手段的检测优势在于，NGS技术不仅可以检测组织样本中的NTRK融合，同时可以通过血浆和胸水等液体样本检测NTRK融合状态；此外，NGS技术检测灵敏度也远高于目前传统检测技术，可以检出1％以下的NTRK融合；除了可以检测常见NTRK融合类型外，NGS技术还可以检测罕见NTRK融合类型；同时NGS相比于传统检测手段，还会可以明确融合伴侣基因，并能检测到许多其他的NTRK基因变异类型，辅助临床靶向治疗方案的制定。
技术实现思路
本专利技术的目的是：提供一种用于检测NTRK融合基因的探针库，利用本专利技术的探针库可以较好地检测到NTRK家族的融合基因，应用于二代测序过程中，能够具有高覆盖率、测序深度均一性好、灵敏度高的优点。一种NTRK家族的融合基因突变的探针库，其中包括有核苷酸序列如SEQIDNO.1～163所示的任意一条探针，或者与其具有相同功能的探针。优选的：探针库中包括上述的全部探针。优选的：所述的具有相同功能的探针，是指将SEQIDNO.1～163任意一条探针经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同杂交捕获功能的探针。优选的：所述的具有相同功能的探针与原探针具有80％以上相同的碱基，更优选是90％以上相同碱基，再优选是95％以上相同碱基。本专利技术提供一种检测NTRK融合基因的方法，所述方法包括以下步骤：1)获得受试者的DNA样本库；2)获得所述的检测NTRK融合基因突变的探针；3)使所述DNA探针库与所述DNA样本库进行杂交；4)分离步骤3)的杂交产物，然后释放经杂交富集的NTRK融合基因DNA片段；5)通过高通量测序的方法对NTRK融合基因DNA片段进行检测。其中，所述步骤1)中的DNA样本库由双链DNA片段组成，并且，所述步骤1)包括：1-1)提取全基因组DNA，然后将其片段化；或者1-2)提取mRNA，将其片段化，然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA；其中，所述受试者为哺乳动物，优选人，且从受试者的细胞、组织或体液样本中提取全基因组DNA或mRNA。优选地，所述DNA片段的长度为150～600bp；进一步优选地，所述DNA片段的长度为150～200bp。一种检测NTRK融合基因的试剂盒，包括有上述的探针库。有益效果本专利技术开发了基于杂交选择而捕获特定NTRK融合基因序列的方法，采用该方法可以获得成几千倍富集的NTRK融合基因DNA片段，该经富集的NTRK融合基因片段样本可以选择性地应用于各种基因检测技术，特别是可以应用下一代测序技术进行基因突变、缺失、增加、和颠换等方面的检测，以取得高效且准确的结果，对相关症状的后续治疗提供有意义的理论及临床指导。并且，对于将通过本专利技术的方法富集得到的NTRK融合基因片段用于基于下一代测序技术的基因结构突变检测的应用而言，还具有以下有益效果：使用本专利技术的基因富集方法及筛选得到的特定DNA探针库，能够成数千倍地富集NTRK融合基因片段，从而可以应用下一代测序技术、利用该NTRK融合基因片段的测序，而准确地获得NTRK融合基因的各种突变。并且，由于采用下一代测序技术，因此能够一次性检测多个基因的多种类型基因突变；准确性高，传统技术例如基因芯片技术，通常需要重复两次以上才能确定检测结果，而本专利技术在一次反应中，对单个碱基进行反复测序，保证了数据的精准度，并且缩短了检测周期；敏感性高，本专利技术提供的方法和试剂盒能够有效地使对于低突变丰度样本的检测灵敏性得到提高，和传统检测技术相比，本专利技术产生的数据能够达到碱基级的分辨率。附图说明图1为本专利技术技术方案的示例性工艺流程图，其中富集得到目标基因群，并用于基于下一代测序技术的基因融合检测。图2为本专利技术的外显子临近内含子探针设计示意图。图3是内含子区域探针设计与传统探针设计测序结果对比图。图4是外显子临近内含子设计与传统探针设计测序结果对比图。具体实施方式下面通过具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在本文中所使用的术语“DNA”为脱氧核糖核酸(英文：Deoxyribonucleicacid，缩写为DNA)是一种由脱氧核糖核苷酸组成的双链分子。可组成遗传指令，引导生物发育与生命机能运行，其碱基排列顺序构成了遗传信息，所以在遗传病的诊断中具有重要的作用。在本文中所使用的术语“高通量测序技术”指的是第二代高通量测序技术及之后发展的更高通量的测序方法。第二代高通量测序平台包括但不限于Illumina-Solexa(Miseq、Hiseq-2000、Hiseq-2500、HiseqXten等本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种NTRK家族的融合基因突变的探针库，其特征在于，其中包括有核苷酸序列如SEQ ID NO. 1～163所示的任意一条探针，或者与其具有相同功能的探针。

【技术特征摘要】
1.一种NTRK家族的融合基因突变的探针库，其特征在于，其中包括有核苷酸序列如SEQIDNO.1～163所示的任意一条探针，或者与其具有相同功能的探针。2.根据权利要求1所述的NTRK家族的融合基因突变的探针库，其特征在于，探针库中包括上述的全部探针。3.根据权利要求1所述的NTRK家族的融合基因突变的探针库，其特征在于，所述的具有相同功能的探针，是指将SEQIDNO.1～163任意一条探针经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同杂交捕获功能的探针。4.根据权利要求1所述的NTRK家族的融合基因突变的探针库，其特征在于，所述的具有相同功能的探针与原探针具有80%以上相同的碱基，更优选是90%以上相同碱基，再优选是95%以上相同碱基。5.一种检测NTRK融合基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1）获得受试者的DNA样本库；2）获得所述的检测NTRK融合基因突变的探针；3）使所述DNA探...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪笑男，邵阳，逄娇慧，包华，朱柳青，
申请(专利权)人：南京世和基因生物技术有限公司，南京世和医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32