一种具有双重可变结构域的双特异性结合的免疫球蛋白制造技术

本发明专利技术公开了一种具有双重可变结构域的双特异性结合的免疫球蛋白，所述的重组免疫球蛋白从氨基端到羧基端包含多肽链Vb‑(X)n‑VLa‑CL，其中，Vb为与靶目标相配对结合的由多个氨基酸组成的多肽链形成的单域结构，X为连接子，n≥0，VLa为轻链的可变结构域，CL为轻链恒定结构域，a为双特异性结合的第一抗原，b为双特异性结合的第二抗原。本发明专利技术的具有双重可变结构域的双特异性结合的免疫球蛋白，空间位阻小，具有较强的肿瘤组织穿透力；分子量与天然抗体接近，半衰期长；分子结构左右对称，不存在错配；由于单域抗体是与天然抗体的轻链融合，不会对重链的亲和力造成影响，因此与两个抗原的亲和力好。

A bispecific binding immunoglobulin with dual variable domains

【技术实现步骤摘要】
一种具有双重可变结构域的双特异性结合的免疫球蛋白
本专利技术属于免疫球蛋白
，涉及双特异性抗原结合的重组免疫球蛋白的制备及其用途，具体涉及一种具有双重可变结构域的双特异性结合的免疫球蛋白。
技术介绍
双特异抗体(Bispecificantibody)是含有两个不同抗原结合位点的免疫球蛋白分子。由于其特异性和双功能性，增加对目标的结合亲和力，现已成为抗体工程领域的研究热点，在肿瘤免疫治疗及自身免疫病等领域中具有广阔的应用前景。由于自然状态下不存在双特异性抗体，只能通过基因工程改造等特殊方法进行制备。由于抗体轻链与其相应重链的配对是基于两条多肽链中的半胱氨酸形成的链间二硫键，配对过程并非特异性，不同肽链之间的随机组合导致了来自两种不同抗原的轻链与重链的配对，在理论上有10种组合形式，其中绝大多数配对为轻链重链错误配对的副产物，所以目前双特异性抗体技术的核心都围绕着解决两种不同抗原的轻链与重链的错配问题。在过去的几年里，研究者开发了各种结构的双特异性抗体。目前的双特异性抗体可分为两类，一类是不含有抗体Fc结构域，代表的有BiTE技术，DART技术与TandAbs技术。BiTE技术是将CD3阳性T细胞结合的抗体可变区的轻链与重链与肿瘤细胞表面抗原结合的抗体的轻链与重链相串联，形成可同时结合CD3阳性T细胞及肿瘤细胞的双特异性结合的多肽。DART技术是由两条多肽链结合形成的异源二聚体抗体，其结构是将一个抗体可变区的VH和VL序列分别与另一个抗体可变区的VL和VH序列连接形成。此外，在两条多肽链的C末端引入了半胱氨酸，通过半胱氨酸形成链间二硫键，提高产品的稳定性。TandAbs技术是由两分子肽链反向配对形成的同源二聚体分子，其结构为Fva-Fvb-Fvb-Fva。此类双特异性结合抗体的缺点是分子量小，半衰期短，例如采用BiTE技术的已上市药物“BLINCYTO”半衰期只有2-3小时，其给药方式一次给药需要用特殊输注装置连续给药24-48小时。另一个缺点是由于不含有抗体的Fc结构，所以不能介导抗体的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC，(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC)，指表达IgGFc受体的NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等，通过与已结合在病毒感染细胞和肿瘤细胞等靶细胞表面的IgG抗体的Fc段结合，而杀伤这些靶细胞的作用)，补体依赖的细胞毒性作用(CDC(complementdependentcytotoxicity，CDC)，通过特异性抗体与细胞膜表面相应抗原结合，形成复合物而激活补体经典途径，所形成的攻膜复合物对靶细胞发挥裂解效应)等抗体免疫杀伤活性功能。从分子结构上讲，这种抗体结构不能算是真正意义上的抗体。含有Fc区的双特异性抗体平台中采用的技术有：(1)通过突变Fc区解决重链错配问题，通过突变或交换轻链恒定区与重链第一恒定区解决轻链错配问题。代表性的技术有罗氏公司开发的“Knobs-into-holes”与“CrossMab”技术、Zymeworks公司开发的Azymetric技术、武汉友芝友公司开发的“YBODY”技术、Trion/Fresenius公司的“Triomab”技术。此类技术在一定程度上减少了错配，但不足之处也显而易见。本领域人员皆知，抗体Fc区介导ADCC，CDC，ADCP等免疫功能，这些免疫功能是抗体分子实现其药学功能的重要方式。人体免疫应答反应是非常复杂的系统，对Fc结构域进行突变会造成未知的免疫副反应，带来巨大的不确定性。上述技术方案都未披露免疫反应的相关研究及安全性数据。其次，轻链的突变或者轻链恒定区(CL)与重链第一恒定区(CH1)的交换也给与抗原的结合活性带来了不确定性。例如，SherisL.Morrison等(TheJournalofImmunology1998，160：2802-2808)研究了抗体重链与轻链可变区交换对抗体功能的影响，指出抗体重链与轻链可变区交换会降低抗体与抗原的结合动力。(2)另一类的技术方案有通过在抗体重链的C端或N端连接第二抗原结合区。代表性的技术方案有：Abbvie公司开发的“DVD-Ig”技术，Merrimack公司的“IgG-scFv”及岸迈生物开发的“FIT-Ig”技术。此类技术的共同特点是分子结构左右对称，解决了错配。一个致命缺陷是在重链连接第二抗原可变区，造成的空间位阻大大影响重链可变区与抗原的结合活性，一方面本领域技术人员悉知，抗体与抗原特异性结合的可变区，起主要特异性结合作用的为重链的可变区，SANDRA.J等的研究也指出在抗体与抗原的特异性结合过程中起决定作用的是抗体重链可变区(VH区)(JImmunol，vol.139：4135-4144.No.12.December15.1987)。甚至在骆驼和鲨鱼类动物体内的抗体只有重链，轻链天然缺失，也叫单域抗体。在专利(专利申请号201510008045.8，US7183076)申请中也报道了一种具有共同轻链的双特异性抗体，此类双特异性抗体具有共同的轻链，与两个不同抗原的特异性结合靠的是重链的可变区，可见，抗体中与抗原结合起主要作用的是重链的可变区。另一方面，上述技术方案是在重链的可变区(VH区)融合第二抗原的Fab片段，势必会对重链可变区与第一抗原的结合造成很大的影响，妨碍抗体功能的实现。而在原申请中也并未给出与两个特异性抗原亲和力的研究数据。此外此类技术方案的抗体分子量远大于天然抗体，大分子量造成的空间位阻难以穿透实体瘤组织，并且大分子量容易引起免疫原性，带来安全性问题。专利技术人认为一个理想的双特异性抗体分子是(1)含有天然抗体Fc区，可以介导ADCC、CDC等抗体对靶目标的免疫杀伤活性，同时含有天然抗体Fc可减低在体内的免疫原性；(2)分子量与天然抗体接近，因此半衰期长，免疫原性低，对实体瘤穿透性好；(3)分子对称，不存在错配，便于纯化与工艺放大生产；(4)与两个抗原都有高的亲和力。第二抗原结合区不会对第一抗原造成空间位阻效应，妨碍第一抗原结合区的结合活性。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种具有双重可变结构域的双特异性结合的免疫球蛋白，将单链结构域与天然抗体的轻链融合，有效解决目前双特异性抗体存在的影响重链亲和力以及错配的问题。本专利技术的另一目的是提供一种上述具有双重可变结构域的双特异性结合的免疫球蛋白的应用。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种具有双重可变结构域的双特异性结合的免疫球蛋白，包含两条多肽链，其中一条多肽链从氨基端到羧基端为Vb-(X)n-VLa-CL，其中，Vb为与靶目标相配对结合的单域结构，X为连接子，n≥0，VLa为轻链的可变结构域，CL为轻链恒定结构域，a为双特异性结合的第一抗原，b为双特异性结合的第二抗原。所述的双特异性结合的免疫球蛋白的第二条多肽链，从氨基端到羧基端为VHa-CH1-Fc，其中，VHa为重链的可变结构域，CH1为重链恒定区的第一恒定结构域。所述的与靶目标相配对结合的单域结构为一条由多个氨基酸组成的多肽链所形成的结构域。所述的结构域为单域抗体的可变区，抗原，细胞因子，细胞因子受体，细胞表面蛋白，趋化因子、趋本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有双重可变结构域的双特异性结合的免疫球蛋白，其特征在于，所述的重组免疫球蛋白包含两条多肽链，其中一条多肽链从氨基端到羧基端为Vb‑(X)n‑VLa‑CL，其中，Vb为与靶目标相配对结合的单域结构，X为连接子，n≥0，VLa为轻链的可变结构域，CL为轻链恒定结构域，a为双特异性结合的第一抗原，b为双特异性结合的第二抗原。

【技术特征摘要】
1.一种具有双重可变结构域的双特异性结合的免疫球蛋白，其特征在于，所述的重组免疫球蛋白包含两条多肽链，其中一条多肽链从氨基端到羧基端为Vb-(X)n-VLa-CL，其中，Vb为与靶目标相配对结合的单域结构，X为连接子，n≥0，VLa为轻链的可变结构域，CL为轻链恒定结构域，a为双特异性结合的第一抗原，b为双特异性结合的第二抗原。2.根据权利要求1所述的具有双重可变结构域的双特异性结合的免疫球蛋白，其特征在于，所述的双特异性结合的免疫球蛋白的第二条多肽链，从氨基端到羧基端为VHa-CH1-Fc，其中，VHa为重链的可变结构域，CH1为重链恒定区的第一恒定结构域。3.根据权利要求1或2所述的具有双重可变结构域的双特异性结合的免疫球蛋白，其特征在于，所述的与靶目标相配对结合的单域结构为一条由多个氨基酸组成的多肽链所形成的结构域。4.根据权利要求3所述的具有双重可变结构域的双特异性结合的免疫球蛋白，其特征在于，所述的结构域为单域抗体的可变区，抗原，细胞因子，细胞因子受体，细胞表面蛋白，趋化因子、趋化因子受体。5.根据权利要求1或3所述的具有双重可变结构域的双特异性结合的免疫球蛋白，其特征在于，所述的单域结构为抗原的胞外结构域。6.根据权利要求1或2所述的具有双重可变结构域的双特异性结合的免疫球蛋白，其特征在于，所述的CH1结构域与CL结构域均为野生型或突变型结构域。7.根据权利要求2所述的具有双重可变结构域的双特异性结合的免疫球蛋白，其特征在于，所述的Fc结构域为野生型或突变型结构域。8.根据权利要求1或2所述的具有双重可变结构域的双特异性结合的免疫球蛋白，其特征在于，所述的单域结构，是指能与靶目标相配对结合的，由多个氨基酸组成的多肽链折叠形成的多肽结构域。9.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜东成，
申请(专利权)人：南京华岩生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32