一种重组杆状病毒、貉细小病毒重组亚单位疫苗及其制备方法技术

一种重组杆状病毒、貉细小病毒重组亚单位疫苗及其制备方法，涉及兽用生物制品及生物领域。本发明专利技术的一种重组杆状病毒，已于2019年4月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.17486，命名为重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒ACMPV‑VP2。本发明专利技术首先构建了能够表达RDPV VP2蛋白的重组杆状病毒，将其接入昆虫细胞生产RDPV亚单位疫苗。所制备的疫苗含有重组RDPV衣壳蛋白，而不含有RDPV病毒基因组成分，从而避免了病毒扩散和基因组释放的风险。本发明专利技术避免了传统疫苗制备工艺存在的成本高的缺点，填补了目前没有貉子专用细小病毒疫苗的空白。

A recombinant baculovirus and mink parvovirus subunit vaccine and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
一种重组杆状病毒、貉细小病毒重组亚单位疫苗及其制备方法
本专利技术涉及兽用生物制品及生物
，具体涉及一种重组杆状病毒、貉细小病毒重组亚单位疫苗及其制备方法。
技术介绍
貉细小病毒性肠炎(raccoondogviralenteritis，RDVE)是由貉细小病毒(RaccoondogParvovirus，RDPV)引起的一种急性、高度接触性传染疾病，该病以腹泻为主要特征，具有较高的发病率和死亡率。RDPV在分类上隶属于细小病毒科(Parvoviridae)，细小病毒属(Parvovirus)，为无囊膜单链DNA病毒。RDPV主要编码两种结构蛋白：VPl和VP2，VP2位于VPl的C端，VP2蛋白的N端氨基酸序列和VPl蛋白的C端氨基酸序列相互重叠，且二者终止于同一密码子(ParrishCR，1999)。VP1蛋白包含727个氨基酸，其中含有584个氨基酸的VP2蛋白和143个氨基酸的独特区。RDPV粒子为直径20～24nm的轴对称的二十面体结构，无囊膜，不含糖类和脂质，结构坚实紧密，粒子内含有单股负链DNA。RDPV的基因组大约为5kb，分子量约为1.5～2.0×106kD。在其基因组中有两个主要的开放阅读框架，它们分别编码结构蛋白(VP1和VP2)和非结构蛋白(NSl和NS2)。RDPV感染貉子后，可引起貉子的肠黏膜炎症、坏死，继而引发貉子的剧烈腹泻，该病发病急、致死率高。RDPV可感染各年龄段的貉子，对幼貉的感染性极强。1984年，貉细小病毒性肠炎在我国黑龙江省首次报道。1988年，夏咸柱等从不同地区肠炎病貉分离出3株貉细小病毒，从而首次证实了貉细小病毒在我国的存在。貉子细小病毒性肠炎的防治也主要以预防为主。目前用于貉子细小病毒性肠炎的疫苗主要是MEV灭活疫苗。该灭活疫苗在灭活过程中使用的灭活剂-甲醛会在一定程度上破坏病毒的蛋白，并且灭活不彻底还会有散毒的风险，灭活疫苗还具有只能刺激机体产生体液免疫、抗体持续期短等缺点。另外，传统的转瓶培养需要使用含血清的培养基培养，而目前血清价格居高不下，并且转瓶培养使用的人力较多，直接造成转瓶培养成本高。目前还没有供貉子防治RDPV的专用疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种貉细小病毒重组亚单位疫苗及其制备方法，用于生产安全、高效的貉子细小病毒性肠炎(RDPV)疫苗。本专利技术的制备方法避免了传统疫苗制备工艺存在的成本高的缺点，填补了目前没有貉子专用细小病毒疫苗的空白。本专利技术为解决技术问题所采用的技术方案如下：本专利技术的一种重组杆状病毒，该毒株已于2019年4月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNO.17486，命名为：表达貉细小病毒VP2基因的杆状病毒。本专利技术的一种重组杆状病毒的构建方法，包括以下步骤：步骤一、构建貉细小病毒结构蛋白VP2基因；步骤二、构建含有貉细小病毒结构蛋白VP2基因的穿梭载体；步骤三、构建含有貉细小病毒结构蛋白VP2基因的昆虫杆状病毒重组表达质粒；步骤四、重组表达质粒转染sf9昆虫细胞；步骤五、制备病毒贮液，获得重组杆状病毒，即表达貉细小病毒VP2基因的杆状病毒。作为优选的实施方式，步骤一的具体过程如下：根据RDPVLN株的基因序列设计引物VP2-U/引物VP2-L，引物VP2-U的序列如SEQIDNO:1所示，引物VP2-L的序列如SEQIDNO:2所示，利用PCR方法扩增VP2基因，PCR扩增条件为：作为优选的实施方式，步骤二的具体过程如下：将PCR产物用限制性内切酶XholⅠ和BamHⅠ双酶切，酶切产物在1％琼脂糖凝胶中电泳；电泳后分离酶切产物，切去含有目的片段的凝胶进行称重；回收酶切产物，将其连接在穿梭载体pFastbac1上，构建出重组穿梭载体pFastbac-VP2。作为优选的实施方式，步骤三的具体过程如下：(1)取重组穿梭载体pFastbac-VP2加入100μlDH10Bac感受态细胞中，混匀，将微量离心管放入事先准备好的含冰的烧杯中，冰浴30min；将离心管放入42℃水浴锅中热激90秒，再放入加冰的烧杯中静置5min；加入LB培养基900μl，37℃摇床220rpm培养4h；6000rpm离心30sec，弃掉上清900μl，用余下的LB重悬菌体，准备10倍稀释的细菌培养物，每板加入100μl的稀释菌液，涂布于含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml的庆大霉素、10μg/ml四环素、100μg/mlX-gal及40μg/mlIPTG的LB平板上，室温放置40min，在37℃温箱内倒置培养48h；用接种环挑取10个克隆于新鲜配制的含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml的庆大霉素及10μg/ml四环素的LB平板中，划线，37℃倒置培养过夜；挑取单菌落接入含10ml抗性LB的试管中，试管中含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml的庆大霉素及10μg/ml四环素，37℃、250rpm摇床培养过夜，获得含有貉细小病毒结构蛋白VP2基因的昆虫杆状病毒重组表达质粒；(2)昆虫杆状病毒重组表达质粒DNA的提取①柱平衡：加入2ml平衡液到柱中，静置直到柱中液体由于重力作用全部滴完；收集1.5ml上述过夜培养的菌液于1.5ml离心管中，12000rpm离心1min；②弃上清液，用0.4ml重悬溶液重悬，直至菌液完全均匀；③加入0.4ml细胞裂解液，反复颠倒混合5次；④加入0.4ml中和液颠倒混合5次，12000rpm离心10min；⑤吸取上清，将上清转移到平衡好的柱子内，重力作用滴干；⑥用2.5ml洗涤液冲洗柱子2次；⑦加入0.9ml洗脱液，保留洗脱液于5ml离心管中；⑧加入0.63ml异丙醇于洗脱液中，混匀，冰浴10min，12000rpm室温离心20min，弃上清，用1ml预冷的70％乙醇溶液重悬沉淀，室温晾干；⑨用灭菌水溶解沉淀DNA，-20℃保存。作为优选的实施方式，步骤四的具体过程如下：(1)sf9昆虫细胞的转染：sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×105个细胞，其中一孔设为正常对照，并以全培培养至少1h，使细胞贴壁；(2)准备重组表达质粒和细胞转染试剂的混合物：a、溶解1μg纯化的重组表达质粒于100μl无添加成分的Grace’sMedium；b、将细胞转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl无添加成分的Grace’sMedium，混匀；c、将上述稀释好的重组表达质粒及稀释好的细胞转染试剂混匀，室温孵育20min。(3)在重组表达质粒与细胞转染试剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’sMedium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液；(4)取0.8ml无添加成分的Grace’sMedium加入重组表达质粒与细胞转染试剂混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml；加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h；(5)移除重组表达质粒与细胞转染试剂混合液，加入2ml全培；(6)27℃培养，直到病变现象产生；如果看到上述的细胞病变，取2ml的细胞收集于灭菌的1.5ml的离心管中，500×g离心5min除去细胞及碎片，将上清转移至新的灭菌1.5ml离心管中，加入2％的胎牛血清，4℃避光保存，即为P1病毒。作为优选的实施方式，步骤五的具体过程如下：在感染当天，准备sf9细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组杆状病毒，其特征在于，该毒株已于2019年4月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.17486，命名为：表达貉细小病毒VP2基因的杆状病毒。

【技术特征摘要】
1.一种重组杆状病毒，其特征在于，该毒株已于2019年4月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNO.17486，命名为：表达貉细小病毒VP2基因的杆状病毒。2.如权利要求1所述的一种重组杆状病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、构建貉细小病毒结构蛋白VP2基因；步骤二、构建含有貉细小病毒结构蛋白VP2基因的穿梭载体；步骤三、构建含有貉细小病毒结构蛋白VP2基因的昆虫杆状病毒重组表达质粒；步骤四、重组表达质粒转染sf9昆虫细胞；步骤五、制备病毒贮液，获得重组杆状病毒，即表达貉细小病毒VP2基因的杆状病毒。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤一的具体过程如下：根据RDPVLN株的基因序列设计引物VP2-U/引物VP2-L，引物VP2-U的序列如SEQIDNO:1所示，引物VP2-L的序列如SEQIDNO:2所示，利用PCR方法扩增VP2基因，PCR扩增条件为：4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤二的具体过程如下：将PCR产物用限制性内切酶XholⅠ和BamHⅠ双酶切，酶切产物在1％琼脂糖凝胶中电泳；电泳后分离酶切产物，切去含有目的片段的凝胶进行称重；回收酶切产物，将其连接在穿梭载体pFastbac1上，构建出重组穿梭载体pFastbac-VP2。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤三的具体过程如下：(1)取重组穿梭载体pFastbac-VP2加入100μlDH10Bac感受态细胞中，混匀，将微量离心管放入事先准备好的含冰的烧杯中，冰浴30min；将离心管放入42℃水浴锅中热激90秒，再放入加冰的烧杯中静置5min；加入LB培养基900μl，37℃摇床220rpm培养4h；6000rpm离心30sec，弃掉上清900μl，用余下的LB重悬菌体，准备10倍稀释的细菌培养物，每板加入100μl的稀释菌液，涂布于含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml的庆大霉素、10μg/ml四环素、100μg/mlX-gal及40μg/mlIPTG的LB平板上，室温放置40min，在37℃温箱内倒置培养48h；用接种环挑取10个克隆于新鲜配制的含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml的庆大霉素及10μg/ml四环素的LB平板中，划线，37℃倒置培养过夜；挑取单菌落接入含10ml抗性LB的试管中，试管中含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml的庆大霉素及10μg/ml四环素，37℃、250rpm摇床培养过夜，获得含有貉细小病毒结构蛋白VP2基因的昆虫杆状病毒重组表达质粒；(2)昆虫杆状病毒重组表达质粒DNA的提取①柱平衡：加入2ml平衡液到柱中，静置直到柱中液体由于重力作用全部滴完；收集1.5ml上述过夜培养的菌液于1.5ml离心管中，12000rpm离心1min；②弃上清液，用0.4ml重悬溶液重悬，直至菌液完全均匀；③加入0.4ml细胞裂解液，反复颠倒混合5次；④加入0.4ml中和液颠倒混合5次，12000rpm离心10min；⑤吸取上清，将上清转移到平衡好的柱子内，重力作用滴干；⑥用2.5ml洗涤液冲洗柱子2次；⑦加入0.9ml洗脱液，保留洗脱液于5ml离心管中；⑧加入0.63ml异丙醇于洗脱液中，混匀，冰浴10min，12000rpm室温离心20min，弃上清，用1ml预冷的70％乙醇溶液重悬沉淀，室温晾干；⑨用灭菌水溶解沉淀DNA，-20℃保存。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪佳，任飞，唐毓，赵江平，吕文雪，闫如勋，许皓，王春霞，李云松，杨升，
申请(专利权)人：吉林特研生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22