一种双荧光标记的重组菌及其制备方法和在研究耐药基因体内转移中的应用技术

本发明专利技术提供了一种双荧光标记的重组菌及其制备方法和在研究耐药基因体内转移中的应用，属于耐药基因研究技术领域，所述重组菌以大肠杆菌为原始菌株，在所述大肠杆菌的基因组上整合有红色荧光标记基因；所述大肠杆菌内有携带绿色荧光标记基因的接合性质粒RK2。本发明专利技术中所述重组菌的基因组上携带红色荧光蛋白基因和绿色荧光蛋白基因；并且所述携带绿色荧光标记基因的接合性质粒RK2能够通过结合作用转入到其他种类细菌细胞内，通过荧光信号检测能够准确的确定通过结合作用转入绿色荧光蛋白的细菌的种类和分布；便于不同种类细菌耐药性强弱的判断以及细菌耐药性产生部位的判断。

A Double Fluorescent Labeled Recombinant Bacteria and Its Preparation Method and Application in the Study of Drug Resistance Gene Transfer in Vivo

【技术实现步骤摘要】
一种双荧光标记的重组菌及其制备方法和在研究耐药基因体内转移中的应用
本专利技术属于耐药基因研究
，尤其涉及一种双荧光标记的重组菌及其制备方法和在研究耐药基因体内转移中的应用。
技术介绍
抗菌药物通过杀灭细菌发挥治疗感染的作用，细菌作为一类广泛存在的生物体，也可以通过多种形式获得对抗菌药物的抵抗作用，逃避被杀灭的危险，这种抵抗作用被称为“细菌耐药”，获得耐药能力的细菌就被称为“耐药细菌”。细菌耐药是一种被人类强化的自然现象。所谓细菌的耐药性，是指细菌多次与药物接触后，对药物的敏感性减小甚至消失，致使药物对耐药菌的疗效降低甚至无效。随着抗生素药物的广泛使用，细菌耐药性问题已成为严重影响人类健康的问题之一，耐药基因作为细菌耐药的物质基础，近年来成为人们关注的热点。而耐药基因在体内转移情况及能转移给哪些受体菌，由于缺乏适当的分选和分析技术，暂时还不清楚。目前，已有很多文献报道了绿色荧光蛋白基因及其衍生物在细菌瞬时表达，质粒的水平转移，病原菌侵入细胞途径及监测体内细菌的迁移和变化等方面的应用。目前尚没有在细菌耐药基因水平转移应用方面的研究。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种双荧光标记的重组菌及其制备方法和在研究耐药基因体内转移中的应用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：一种双荧光标记的重组菌，所述重组菌以大肠杆菌为原始菌株，在所述大肠杆菌的基因组上整合有红色荧光标记基因；所述大肠杆菌内有携带绿色荧光标记基因的接合性质粒RK2。优选的，所述大肠杆菌为E.coliATCC47076。优选的，所述红色荧光标记基因通过同源重组的方式整合到所述大肠杆菌的基因组上aslA酶切位点和aslB酶切位点之间。本专利技术提供了所述的重组菌的制备方法，包括以下步骤：1)构建携带红色荧光标记基因的打靶载体；2)将所述打靶载体转入原始菌株大肠杆菌中获得基因组上整合有红色荧光标记基因的第一重组菌株；3)将携带有绿色荧光标记基因的接合性质粒RK2转入所述第一重组菌株中获得双荧光标记的重组菌。本专利技术提供了所述的重组菌在研究耐药基因体内转移中的应用。优选的，所述应用包括以下步骤：1)用所述重组菌喂食动物18～22d后，解剖所述动物，并收集粪便细菌和肠道细菌；2)检测所述粪便细菌或肠道细菌的荧光信号，若所述粪便细菌或肠道细菌中出现绿色荧光信号，说明所述粪便细菌或肠道细菌接受了重组菌中的接合质粒，易于产生耐药性；若所述粪便细菌或肠道细菌中没有出现绿色荧光信号，说明所述粪便细菌或肠道细菌没有接受重组菌中的接合质粒，不易产生耐药性。优选的，步骤1)中所述动物为斑马鱼。优选的，所述重组菌喂食的量为1～9×108CFU/d/条。优选的，所述粪便细菌和肠道细菌的收集采用流式细胞分选实现。优选的，检测肠道不同位置分离获得的肠道细菌的绿色荧光信号，根据肠道不同位绿色荧光信号出现的的数量和细菌种类比例确定肠道不同位置细菌耐药性产生的概率。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的双荧光标记的重组菌，以大肠杆菌为原始菌株，在所述大肠杆菌的基因组上整合有红色荧光标记基因；所述大肠杆菌内有携带绿色荧光标记基因的接合性质粒RK2。本专利技术中所述重组菌的基因组上携带红色荧光蛋白基因，细胞内还存在质粒携带绿色荧光蛋白基因；所述重组菌携带的两种荧光标记基因便于对所述重组菌分布的检测；并且所述携带绿色荧光标记基因的接合性质粒RK2能够通过结合作用转入到其他种类细菌细胞内，通过荧光信号检测能够准确的确定通过结合作用转入绿色荧光蛋白的细菌的种类和分布；便于不同种类细菌耐药性强弱的判断以及细菌耐药性产生部位的判断。附图说明图1为aslA和aslB基因扩增产物的电泳图；图2为电转化大肠杆菌K12中pSC101-BAD-gbaA-tet质粒PCR产物的验证；图3为克隆子中打靶载体线性片段PCR产物的电泳检测；图4为K12-Tdtomato转化子的荧光检测；图5为EGPF-RK2载体酶切产物电泳图；图6为K12Td-tomato:RK2(EGFP)的绿色荧光验证；图7为K12Td-tomato:RK2(EGFP)的双荧光验证；图8为供体菌和接合子的3D-SIM超分辨率荧光显微镜下照片；其中A：供体菌K12Td-tomato:RK2(EGFP)；B:供体菌K12Td-tomato(不带质粒)；C：供体菌和接合子；(1)编码在基因组上的Td-tomato基因表达的红色荧光；(2)编码在质粒上的EGFP基因表达的绿色荧光；(3)来自不同荧光信号的重叠图像；图9为肠道和粪便样品中供体菌和接合子的流式细胞分析；其中A：前肠；B:中肠；C：后肠；D：粪便。图10为斑马鱼肠道和粪便中接合子的物种注释和丰度分析；每格的颜色从蓝到红代表相应物种的丰度逐渐增加；FGG：前肠；MGG：中肠；HGG：后肠；FEG：粪便。具体实施方式本专利技术提供了一种双荧光标记的重组菌，所述重组菌以大肠杆菌为原始菌株，在所述大肠杆菌的基因组上整合有红色荧光标记基因；所述大肠杆菌内有携带绿色荧光标记基因的接合性质粒RK2。本专利技术对所述大肠杆菌的来源和种类没有特殊限定，采用本领域常规大肠杆菌即可。在本专利技术具体实施过程中，所述大肠杆菌优选为E.coliATCC47076，购自ATCC(Americantypeculturecollection)。在本专利技术中，所述红色荧光标记基因优选为Td-Tomato基因；所述Td-Tomato基因的核苷酸序列优选的如SEQIDNO：1所示。在本专利技术中，所述Td-Tomato基因优选的通过同源重组的方式整合到所述大肠杆菌的基因组上aslA酶切位点和aslB酶切位点之间。在本专利技术中，所述携带绿色荧光标记基因的接合性质粒RK2优选的通过将所述绿色荧光蛋白标记基因连接至结合性质粒RK2中获得；在本专利技术中，所述结合性质粒RK2优选的购于质粒载体菌种细胞基因保藏中心(NTCC)。在本专利技术中，所述绿色荧光蛋白标记基因优选的插入到所述结合性质粒RK2的BamHI和EcoRI酶切位点之间。本专利技术对所述绿色荧光蛋白标记基因连接至结合性质粒RK2的方法没有特殊限定，采用本领域常规方法即可。本专利技术提供了所述的重组菌的制备方法，包括以下步骤：1)构建携带红色荧光标记基因的打靶载体；2)将所述打靶载体转入原始菌株大肠杆菌中获得基因组上整合有红色荧光标记基因的第一重组菌株；3)将携带有绿色荧光标记基因的接合性质粒RK2转入所述第一重组菌株中获得双荧光标记的重组菌。在本专利技术中，构建携带红色荧光标记基因的打靶载体。在本专利技术中，所述打靶载体优选的以pet32a载体为初始载体，在所述pet32a载体上依次连接aslB基因-GB2基因-红色荧光蛋白基因Td-Tomato-GB2基因-KanR基因-aslA基因。在本专利技术中，所述aslA基因和aslB基因为大肠杆菌的硫酸酶家族基因；本专利技术通过打靶载体上的aslA基因和aslB基因与原始菌株中的aslA基因和aslB基因进行同源重组，将所述红色荧光蛋白基因插入到原始菌株中的aslA基因和aslB基因之间。在本专利技术中，所述aslA基因和aslB基因的DNA片段，以大肠杆菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得。本专利技术对所述PCR扩增的体系和程序没有特殊限定，采用本领域常规的PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双荧光标记的重组菌，其特征在于，所述重组菌以大肠杆菌为原始菌株，在所述大肠杆菌的基因组上整合有红色荧光标记基因；所述大肠杆菌内有携带绿色荧光标记基因的接合性质粒RK2。

【技术特征摘要】
1.一种双荧光标记的重组菌，其特征在于，所述重组菌以大肠杆菌为原始菌株，在所述大肠杆菌的基因组上整合有红色荧光标记基因；所述大肠杆菌内有携带绿色荧光标记基因的接合性质粒RK2。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coliATCC47076。3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于，所述红色荧光标记基因通过同源重组的方式整合到所述大肠杆菌的基因组上aslA酶切位点和aslB酶切位点之间。4.权利要求1～3任意一项所述的重组菌的制备方法，包括以下步骤：1)构建携带红色荧光标记基因的打靶载体；2)将所述打靶载体转入原始菌株大肠杆菌中获得基因组上整合有红色荧光标记基因的第一重组菌株；3)将携带有绿色荧光标记基因的接合性质粒RK2转入所述第一重组菌株中获得双荧光标记的重组菌。5.权利要求1～3任意一项所述的重组菌在研究耐药基因体内转移或体内细菌耐药性中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨栋，李君文，邱志刚，付佳伦，金敏，尹静，谌志强，杨忠委，师丹阳，王华然，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12