采用乳酸生产L-丙氨酸的方法及菌株技术

本发明专利技术公开了一种工程菌及其在生产L‑丙氨酸中的应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术的重组大肠杆菌同时表达了外源L‑乳酸脱氢酶和L‑丙氨酸脱氢酶，并在宿主大肠杆菌的基础上强化表达了乳酸转运基因和NAD合成基因。本发明专利技术在改造大肠杆菌转运及辅酶合成体系的基础上，构建了双酶共表达的工程菌，实现了采用廉价原料高效生产L‑丙氨酸。

Production of L-alanine by lactic acid and its strains

【技术实现步骤摘要】
采用乳酸生产L-丙氨酸的方法及菌株
本专利技术涉及采用乳酸生产L-丙氨酸的方法及菌株，属于生物工程

技术介绍
L-丙氨酸是一种重要的氨基酸，化工、食品、医药等领域有着广泛的应用。目前L-丙氨酸的生产主要有化学法、酶转化法和发酵法。酶转化法主要是通过天冬氨酸脱羧生产，但天冬氨酸本身价较高。也有以苹果酸为底物，将苹果酸酶与L-丙氨酸脱氢酶共固定生产的方法，但苹果酸本身价格很高，很难实现工业化生产。基因工程菌以葡萄糖为原料发酵生产L-丙氨酸则存在糖酸转化率低、发酵液组成复杂导致提取困难的问题。
技术实现思路
基于目前各种方法的缺陷，本专利技术提出了转化乳酸产L-丙氨酸的生产方法，在改造大肠杆菌转运及辅酶合成体系的基础上，构建了双酶共表达的工程菌，实现了L-丙氨酸的高效生产。本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能利用廉价原料生产L-丙氨酸的重组菌，同时本专利技术还解决该菌株的构建和应用的技术问题。本专利技术的第一个目的是提供能低成本生产纯L-丙氨酸的重组大肠杆菌；所述重组大肠杆菌同时表达了外源L/D-乳酸脱氢酶和L-丙氨酸脱氢酶。在一种实施方式中，所述外源L/D乳酸脱氢酶为乳酸菌来源的L/D-乳酸脱氢酶。外源的L-丙氨酸脱氢酶为芽孢杆菌、海洋细菌或放线菌来源的L-丙氨酸脱氢酶。在一种实施方式中，所述L-乳酸脱氢酶来自于LactococcuslactisATCC19257、LactobacillusplantarumATCC14917。在一种实施方式中，所述L-乳酸脱氢酶的氨基酸序列是NCBI上accessionNO为WP_003131075.1、KRL33571.1的序列。在一种实施方式中，所述L-乳酸脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accessionNO为：NZ_JXJZ01000017REGION:18532..19509、AZEJ01000016REGION:16296..17249的序列。在一种实施方式中，所述D-乳酸脱氢酶来自于LactococcuslactisATCC19257、LactobacillusplantarumATCC14917。在一种实施方式中，所述D-乳酸脱氢酶的氨基酸序列是NCBI上accessionNO为WP_014573232.1、KRL35110.1的序列。在一种实施方式中，所述D-乳酸脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accessionNO为：NZ_JXJZ01000008REGION:complement(31625..32602)、AZEJ01000004REGION:38463..39455的序列。在一种实施方式中，所述L-丙氨酸脱氢酶来自BacillusmegateriumDSM319、PhaeobacterinhibensDSM17395、StreptomycescorchorusiiDSM40340。在一种实施方式中，所述L-丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列是NCBI上accessionNO为WP_013085206.1、WP_014881174.1、WP_014671828.1序列。在一种实施方式中，所述L-丙氨酸脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accessionNO为：NC_014103REGION:complement(4614172..4615293)、NC_018290REGION:3177716..3178831、NZ_KQ948369REGION:24418..25542。在一种实施方式中，所述L-乳酸脱氢酶和L-丙氨酸脱氢酶是通过pETDuet-1共表达的。在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌还强化表达了乳酸转运基因(把乳酸转运至细胞内的基因)、NAD合成基因(大肠杆菌NAD合成途径的关键酶)的一种或者多种。在一种实施方式中，所述强化表达的基因为lldP(乳酸转运基因)、icsA(NAD合成基因)、nadA(NAD合成基因)中的任意一种或多种。在一种实施方式中，所述宿主菌为EscherichiacoliBL21(DE3)。在一种实施方式中，所述强化表达是通过将EscherichiacoliBL21(DE3)基因组上所要强化表达的基因前增加组成型启动子。在一种实施方式中，所述lldP在NCBI上accessionNO为：NC_012892REGION:3646638..3648293；icsA为NC_012892REGION:complement(2526116..2527330)；nadA为NC_012892REGION:740487..741530。本专利技术的第二个目的是提供一种生产光学纯L-丙氨酸的方法，所述方法是利用本专利技术的重组菌。在一种实施方式中，所述生产L-丙氨酸，是进行全细胞转化生产。在一种实施方式中，所述全细胞转化生产的体系中，细胞湿重1-200g/L，L-乳酸1-300g/L，氯化铵1-350g/L，pH4.0-9.0，温度15-40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间1-24小时。本专利技术的第三个目的是提供本专利技术重组菌在化工、食品、医药等领域的应用。本专利技术的第四个目的是提供本专利技术方法在化工、食品、医药等领域的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术构建了一种新型的双酶共表达基因工程菌，该菌可应用于L-丙氨酸的生产。本专利技术选择的底物廉价，并且细胞内有较高的NAD含量。该生产过程简单且原料易得，具有良好的工业化应用前景。具体实施方案本专利技术的大肠杆菌工程菌的功能核心是可以共表达两种酶，分别为乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase)、丙氨酸脱氢酶(Alaninedehydrogenase)。其原理为：在工程菌全细胞内，L-乳酸脱氢酶以菌体内的NAD为辅酶将L-乳酸脱氢生成L-丙氨酸和NADH；L-丙氨酸脱氢酶将丙酮酸、氨合成为L-丙氨酸，NADH则氧化生成NAD，实现了辅酶NAD的再生。同时敲除或强化表达大肠杆菌基因组上的相关基因促进乳酸的转运和防止L-丙氨酸的分解。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：1、本专利技术所涉及的菌株及质粒购自美国菌种保藏中心ATCC的LactobacillusplantarumATCC14917、LactococcuslactisATCC19257购自Novagen公司的pETDuet-1、pACYCDue-1、pCOLADuet-1、pRSFDuet-1质粒和EscherichiacoliBL21(DE3)。BacillusmegateriumDSM319、PhaeobacterinhibensDSM17395、StreptomycescorchorusiiDSM40340购自德国微生物菌种保藏中心DSMZ。pCasRed、pCRISPR-gDNA购自镇江爱必梦生物科技有限公司。2、大肠杆菌中相关基因的组成型强化表达(1)大肠杆菌乳酸转运基因的组成型强化表达在全细胞转化过程中，需把乳酸转运至细胞内才能进行脱氢生产L-丙氨酸，增强乳酸转运蛋白有助于快速并长时间维持胞内乳酸的高浓度，有利于脱氢的进行。选择的基因是lldP，NCBI上accessionNO为：NC_012892REGION:3646638..3648293。(2)大肠杆菌NAD合成相关基因的过表达在乳酸脱氢过程中需要以NAD为辅酶，强化表达大肠杆菌NA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌同时表达了外源L‑乳酸脱氢酶和L‑丙氨酸脱氢酶。

【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌同时表达了外源L-乳酸脱氢酶和L-丙氨酸脱氢酶。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述外源乳酸脱氢酶为乳酸菌来源的乳酸脱氢酶，外源的L-丙氨酸脱氢酶为芽孢杆菌、海洋细菌或放线菌来源的L-丙氨酸脱氢酶。3.根据权利要求1-2任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌还强化表达了乳酸转运基因、NAD合成基因的一种或者多种。4.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述强化表达的基因为lldP、icsA、nadA中的任意一种或多种。5.根据权利要求3或4所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述强化表达是通过将宿主大肠杆菌基因组上所要强化表达的基因前增加组成型启动子。6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡宇杰，梁鑫鑫，蒋静，丁彦蕊，白亚军，郑晓晖，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32