一种植物乳杆菌菌剂及其高密度发酵制备方法以及应用技术

本发明专利技术公开了一种植物乳杆菌菌剂及其高密度发酵制备方法，属于生物技术领域，其工艺流程包括植物乳杆菌的高密度发酵培养以及菌剂的冷冻干燥工艺。本发明专利技术的植物乳杆菌高密度发酵培养中，在发酵过程中进行蔗糖补料，所述蔗糖补料方式为：当发酵培养至7‑8h，以5‑6mL/L·h的速率开始补料；当发酵培养至11‑15h后，以10‑18mL/L·h速率补料，继续发酵至17‑18h后，以10‑15mL/min速率补料，继续发酵1‑2h结束；通过向菌体中加入冻干保护剂获得植物乳杆菌菌剂。本发明专利技术由于采用分多阶段差异化补料，最终发酵获得的活菌数超过10

A Lactobacillus plantarum Bacterial Agent and Its High Density Fermentation Method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种植物乳杆菌菌剂及其高密度发酵制备方法以及应用
本专利技术属于生物
，涉及一种植物乳杆菌菌剂及其高密度发酵制备方法以及应用。
技术介绍
在70年代初，欧美等国家就开始研制新型微生态制剂，希望在一定程度上替代抗生素，并起到调节人体免疫力的效果。近年来，随着我国消费人群对微生态制剂认识的不断加深与了解，乳酸菌微生态制剂以其调理胃肠道和提高免疫力方面的显著优势，越来越受到人们的广泛关注。植物乳杆菌作为胃肠道的益生菌群，具有维持肠道内菌群平衡、提高机体免疫力和促进营养物质吸收等多种功能，植物乳杆菌通过胃而定植于肠道来发挥其益生作用，无论在食品发酵，还是在医疗保健等领域，都有着广泛的应用。高密度培养技术，也就是高密度发酵技术。一般来说，高密度培养是指应用一定的培养技术或装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较传统培养方式有显著的提高，从而达到减少培养体积，还可以缩短生产周期，最终提高特定产物的比生产速率，减少设备投资从而降低生产成本，提高在市场上的竞争力。发酵液经离心收集菌体、添加一定比例的保护剂后，经过干燥工艺得到冻干菌粉。如公开号为CN101302488A的专利技术专利《一种生产乳酸的方法及其专用植物乳杆菌》，公开了本专利技术公开了一种生产D－乳酸的方法及其专用植物乳杆菌。本专利技术所提供的植物乳杆菌是植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)SMB－2CGMCCNo.2566。在35－39℃的条件下静置培养植物乳杆菌48小时即可得到D－乳酸。发酵液中总乳酸的浓度为18％，D－乳酸的光学纯度为84-86％，发酵产率为3.75g/L·h。且该植物乳杆菌易于沉降到发酵罐底部进行生长，有利于工业生产中菌－液的分离纯化，可以降低乳酸工业生产的成本，具有重要的工业应用价值。其发酵条件为35-39℃静置培养48小时。所述发酵培养方式为分批补料发酵培养，每12小时补加60mL1000g/L的葡萄糖一次。但该补料方法较为粗放，并未考虑菌种在生长不同阶段的性能，易造成糖源浓度过高而产生对菌种的生长抑制作用。公开号为CN102864096A的专利技术专利《一株植物乳杆菌及其高密度培养和冻干菌粉制备的方法》，其技术方案是：其特征在于：所述植物乳杆菌(LactobacillusplantarumP8)是分离自内蒙古巴彦淖尔市乌拉特中旗传统发酵乳制品(酸牛奶)中的一株益生菌，具有人工胃液和人工消化液耐受性、胆盐耐受性、肠道凝集作用及抑制常见肠道致病菌等特性；该菌菌株已于2011年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCCNo.5468。高密度发酵液，发酵液活菌数可达1010cfu/ml以上，得到植物乳杆菌(LactobacillusplantarumP8)冻干菌粉。菌粉的活菌数可达4×1011cfu/g以上。综上，现有技术中，为提供菌株活力和稳定性，在高密度培养过程中，往往通过筛选高活力菌种，分批补料等方式，补料成分往往较为复杂，补料量较大，同时发酵工艺较为粗放，未根据菌种不同阶段的生长性能出发，提高发酵菌种活力。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种植物乳杆菌菌剂及其高密度发酵制备方法以及应用，以解决现有技术中存在的问题，提高其高密度发酵水平、增强植物乳杆菌的抗冻能力，提高产品活菌数。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种植物乳杆菌菌剂的高密度发酵制备方法，步骤如下：将植物乳杆菌经种子培养后，按照接种量3-5％接入发酵培养基，震荡培养，发酵过程中通过添加蔗糖进行补料，所述补料的蔗糖浓度为800-1000g/L，所述蔗糖补料方式为：当发酵培养至7-8h，以5-6mL/L·h的速率开始补料；当发酵培养至11-15h后，蔗糖残留量为0.04-0.10％时，以10-18mL/L·h速率补料，继续发酵至17-19h后，蔗糖残留量为0.10-0.15％时，以10-15mL/min速率补料，继续发酵1-2.5h结束，将所得发酵液经离心获得菌体，向所述菌体中加入冻干保护剂混合，并经冷冻干燥获得植物乳杆菌菌剂。利用该发酵方式获得的菌体含量较常规发酵方法明显上升，此时OD600值能达到30以上。经过活菌计数，发酵后测定的活菌数达到1.0×1011cfu/mL以上。优选地，所述蔗糖补料方式为：发酵培养7-8h，蔗糖残留量为0.04-0.06％时，以5-6mL/L·h的速率开始补料，发酵培养至11-12h后，蔗糖残留量为0.04-0.1％时，以10-15mL/L·h速率补料，发酵至14-15h后，蔗糖残留量为0.05-0.10％时，以15-18mL/L·h速率继续流加培养，继续发酵至18-19h后，蔗糖残留量为0.10-0.15％时，以10-15mL/min速率补料，继续发酵1.5-2.5h结束。利用该发酵方式获得的菌体含量较常规发酵方法明显上升，此时OD600值能达到35以上。经过活菌计数，发酵后测定的活菌数达到2.0×1011cfu/mL以上；优选地，所述发酵培养过程中，发酵培养温度为35-37℃，搅拌转速90-100r/min，维持发酵pH6.1-6.3。优选地，所述冻干保护剂组成为：脱脂奶粉750-800g/L、乳糖450-500g/L、丙三醇20-50g/L、1-20g/L谷氨酸钠、VC5-10g/L，余量为浓度为0.1M，pH为6.2的PBS溶液。优选地，所述发酵培养基组成为：蛋白胨8-10g/L，蔗糖15-20g/L，酵母粉15-20g/L，MgSO4﹒7H2O0.2-0.5g/L，MnSO40.1-0.2g/L，K2HPO41-3g/L，0.5-1g/L的甘蔗糖蜜，乙酸钠3-5g/L，吐温801.0-2.0mL/L，消泡剂0.3-0.5mL/L，余量为水。优选地，所述一种植物乳杆菌菌剂的高密度发酵制备方法，具体步骤如下：(1)种子培养：将植物乳杆菌接入种子液体培养基中35-37℃培养箱中静置活化培养21-24h，得到一级种子液；将所述一级种子液以接种量3-5％接种于种子液体培养基中，35-37℃静置培养21-24h，得到二级种子液；将所述二级种子液以接种量3-5％接入种子液体培养基中，35-37℃静置培养21-24h，得到三级种子液；(2)发酵培养：将所述三级种子液以接种量3-5％接入发酵培养基中，发酵培养温度为35-37℃，搅拌转速90-100r/min，利用50％的氨水调节恒定pH6.1-6.3，并且通入氮气维持发酵罐压力为0.04-0.06MPa；发酵过程中采取蔗糖补料，所述补料的蔗糖浓度为800-1000g/L，所述蔗糖补料方式为：当发酵培养7-8h，蔗糖残留量为0.04-0.06％时，以5-6mL/L·h的速率开始补料；当发酵培养至11-15h后，蔗糖残留量为0.04-0.10％时，以10-18mL/L·h速率补料，继续发酵至17-19h后，蔗糖残留量为0.10-0.15％时，以10-15mL/min速率补料，继续发酵1-2.5h结束；(3)菌剂制备：将得到的植物乳杆菌的发酵液经5000-10000g离心，得到菌泥；将冻干保护剂与菌泥按照质量比2-4：1的比例混合搅拌，经预冷处理后，于温度-55℃—-60℃，真空度1-7Pa，处理10-12h，经干燥18-30h后得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种植物乳杆菌菌剂的高密度发酵制备方法，其特征在于：步骤如下：将植物乳杆菌经种子培养后，按照接种量3‑5％接入发酵培养基，震荡培养，发酵过程中进行蔗糖补料，所述补料的蔗糖浓度为800‑1000g/L，所述蔗糖补料方式为：当发酵培养至7‑8h，蔗糖残留量为0.04‑0.06％时，以5‑6mL/L·h的速率开始补料；当发酵培养至11‑15h后，蔗糖残留量为0.04‑0.10％时，以10‑18mL/L·h速率补料，继续发酵至17‑19h后，蔗糖残留量为0.10‑0.15％时，以10‑15mL/min速率补料，继续发酵1‑2.5h结束，将所得发酵液经离心获得菌体，向所述菌体中加入冻干保护剂混合，并经冷冻干燥获得植物乳杆菌菌剂。

【技术特征摘要】
1.一种植物乳杆菌菌剂的高密度发酵制备方法，其特征在于：步骤如下：将植物乳杆菌经种子培养后，按照接种量3-5％接入发酵培养基，震荡培养，发酵过程中进行蔗糖补料，所述补料的蔗糖浓度为800-1000g/L，所述蔗糖补料方式为：当发酵培养至7-8h，蔗糖残留量为0.04-0.06％时，以5-6mL/L·h的速率开始补料；当发酵培养至11-15h后，蔗糖残留量为0.04-0.10％时，以10-18mL/L·h速率补料，继续发酵至17-19h后，蔗糖残留量为0.10-0.15％时，以10-15mL/min速率补料，继续发酵1-2.5h结束，将所得发酵液经离心获得菌体，向所述菌体中加入冻干保护剂混合，并经冷冻干燥获得植物乳杆菌菌剂。2.如权利要求1所述一种植物乳杆菌菌剂的高密度发酵制备方法，其特征在于：所述蔗糖补料方式为：发酵培养7-8h，蔗糖残留量为0.04-0.06％时，以5-6mL/L·h的速率开始补料，发酵培养至11-12h后，蔗糖残留量为0.04-0.1％时，以10-15mL/L·h速率补料，发酵至14-15h后，蔗糖残留量为0.05-0.10％时，以15-18mL/L·h速率继续流加培养，继续发酵至18-19h后，蔗糖残留量为0.10-0.15％时，以10-15mL/min速率补料，继续发酵1.5-2.5h结束。3.如权利要求1所述一种植物乳杆菌菌剂的高密度发酵制备方法，其特征在于：所述冻干保护剂组成为：脱脂奶粉750-800g/L、乳糖450-500g/L、丙三醇20-50g/L、谷氨酸钠1-20g/L、VC5-10g/L，余量为浓度为0.1M，pH为6.2的PBS溶液。4.如权利要求1所述一种植物乳杆菌菌剂的高密度发酵制备方法，其特征在于：所述发酵培养基组成为：蛋白胨8-10g/L，蔗糖15-20g/L，酵母粉15-20g/L，MgSO4﹒7H200.2-0.5g/L，MnSO40.1-0.2g/L，K2HPO41-3g/L，0.5-1g/L的甘蔗糖蜜，乙酸钠3-5g/L，吐温801.0-2.0mL/L，消泡剂0.3-0.5mL/L，余量为水。5.权利要求1所述一种植物乳杆菌菌剂的高密度发酵制备方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：王连民，高应瑞，刘珂飞，孟铁健，
申请(专利权)人：天津生机集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12