用汉逊酵母表达系统产生HPV33 L1蛋白的方法技术方案

本发明专利技术涉及用汉逊酵母表达系统产生HPV33 L1蛋白的方法。具体地，本发明专利技术公开了产生表达HPV33 L1蛋白的重组汉逊酵母细胞的方法以及由所述方法产生的重组汉逊酵母细胞。本发明专利技术还公开了利用所述重组汉逊酵母细胞产生HPV33 L1蛋白的方法以及所产生的HPV33 L1蛋白在制备预防性疫苗中的用途。

Production of HPV33 L1 protein by Hansen yeast expression system

【技术实现步骤摘要】
用汉逊酵母表达系统产生HPV33L1蛋白的方法本申请为申请日为2013年5月17日、申请号为201310183593.5、专利技术名称为“用汉逊酵母表达系统产生HPV33L1蛋白的方法”的专利技术专利申请的分案申请。专利
本专利技术属于医药生物工程
，涉及产生HPV33L1蛋白的方法，尤其涉及用汉逊酵母表达系统产生HPV33L1蛋白的方法。
技术介绍
人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是一种无包膜的闭环双链DNA病毒，属乳多空病毒科多瘤病毒亚科，主要侵犯人体的上皮黏膜组织，进而诱发各种良性及恶性增生病变。目前已鉴定出来的不同亚型HPV超过200种，HPV感染具有明显的组织特异性，不同型别的HPV对于皮肤和黏膜的嗜向性不同，能诱发不同的乳头状病变，大约有30多种HPV型别与生殖道感染有关，其中有20多种与肿瘤相关。根据HPV诱发病变的良恶性不同，HPV可大致分为两类：1)高危型(如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68等)：高危型HPV与人类多种组织恶性肿瘤密切相关，主要引起重度不典型增生和浸润癌；2)低危型(如HPV6、HPV11、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV54、HPV72、HPV81等)：低危型HPV可引起表皮细胞良性增殖性性病，如尖锐湿疣和扁平湿疣等。HPV主要由病毒外壳和基因组DNA构成。基因组长约7900bp，有8个病毒蛋白编码基因。其中6个ORF编码的蛋白在病毒复制的早期表达，称为早期蛋白；2个ORF编码的蛋白在病毒复制的晚期表达，称为晚期蛋白。晚期蛋白包括主要外壳蛋白L1及次要外壳蛋白L2，并参与病毒外壳的形成。HPV病毒外壳蛋白能够进行自组装，在多种表达系统中单独表达的L1蛋白或将L1蛋白与L2蛋白共表达时均能自组装成病毒样颗粒(virus-likeparticle，VLP)，其中以在酵母系统、杆状病毒昆虫表达系统及哺乳动物细胞表达系统等产生的VLP更接近天然病毒的结构。利用外源表达体系生产的VLP免疫后能够在体内诱发产生中和抗体，获得良好的免疫保护效果。多形汉逊酵母(HansenulaPolymorpha)，又称作Pichiaaugusta，是当前公认的最为理想的外源基因表达系统之一。多形汉逊酵母作为单细胞真核微生物，既具备原核生物生长快速、易于遗传操作等特点，又有真核细胞翻译后加工和修饰等功能。此外，汉逊酵母还具备安全性好、易于培养、成本低廉、表达量高及遗传稳定等优势，并且能够克服诸如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株不稳定、产量低及糖基化侧链过长以及毕赤酵母(PichiaPastoris)外源基因整合拷贝数较低的问题。目前，应用汉逊酵母表达系统生产的药物(如胰岛素，商品名Wosulin)及HBV疫苗(商品名Hepavax-Gene)均已上市销售。在中国专利技术专利公开CN102586287A及CN102719453A中公开了应用汉逊酵母表达系统表达HPV16及HPV18型别L1VLP的方法。然而关于HPV33型别的L1蛋白是否可在汉逊酵母系统中实现高效表达并组装成VLP颗粒，目前并没有公开报道。在上述2篇已公开的专利申请中，未给出HPV16及HPV18L1的外源基因整合拷贝数的结果及提高外源基因拷贝数的方法。在外源蛋白的诱导表达方面，HPV16及HPV18L1在发酵罐中的诱导时间均需超过20小时，且没有提供蛋白表达水平的具体信息。此外，作为一个重要蛋白纯化指标，关于纯化过程及纯化完成时外源蛋白HPV16及HPV18L1的纯度也没有公开。为实现HPV33L1蛋白在汉逊酵母中的高效表达并且能够纯化获得高纯度的HPV33VLP蛋白，在本专利技术中，应用了Zeocin抗性筛选结合G418抗性筛选的双重筛选策略，特别应用了浓度高达16mg/ml的G418抗性平板筛选传代并稳定后的重组汉逊酵母表达菌株。通过检测，筛选获得的HPV33高表达菌株的拷贝数可超过60个拷贝。在发酵诱导过程中，通过提高诱导表达温度至35℃可以显著提高HPV33L1蛋白的表达水平。此外，针对VLP纯化过程中常用的层析介质POROS50HS在纯化HPV33VLP时不易洗脱(高浓度NaCl洗脱目标蛋白时仍有50％目标蛋白挂柱)的特点，本专利技术使用POROSXS层析介质，使得目标HPV33L1蛋白在高浓度NaCl洗脱时能够实现80％以上蛋白的洗脱，从而大幅提高了HPV33L1蛋白的产量。专利技术概述在第一个方面，本专利技术提供了一种产生表达HPV33L1蛋白的重组汉逊酵母细胞的方法，其包含以下步骤：a)通过将包含编码HPV33L1蛋白的核苷酸序列的外源多核苷酸插入载体来构建表达构建体；b)用步骤a)中获得的表达构建体转化汉逊酵母细胞；和c)对步骤b)中获得的汉逊酵母细胞进行筛选，获得含有所述外源多核苷酸的重组汉逊酵母细胞。在第二个方面，本专利技术还提供了根据上述方法产生的重组汉逊酵母细胞。在第三个方面，本专利技术还提供了一种产生HPV33L1蛋白的方法，包括以下步骤：i)在适于HPV33L1蛋白表达的条件下培养本专利技术的重组汉逊酵母细胞；和ii)从培养物中回收并纯化HPV33L1蛋白。在最后一个方面，本专利技术还提供了根据本专利技术的方法产生的HPV33L1蛋白在制备用于预防HPV33感染的疫苗中的用途。附图说明图1重组汉逊酵母细胞表达水平的SDS-PAGE检测。1-8：8株不同重组汉逊酵母菌株的诱导表达；9：标准品(10μg/mL)；10：蛋白质分子量标志物。图2以MOX启动子片段为探针的Southern印迹检测结果。以ATCC26012基因组DNA为对照。1：对照(上样量为1000ng)；2：对照(上样量为500ng)；3：对照(上样量为250ng)；4：对照(上样量为125ng)；5：高表达重组菌HP-1#/pRMHP2.1-33hp的基因组DNA(上样量为7.8ng，其亮度介于500ng和1000ng对照之间)；6：高表达重组菌HP-2#/pRMHP2.1-33hp的基因组DNA(上样量为7.8ng，其亮度介于500ng和1000ng对照之间)。图3发酵过程中HPV33L1蛋白表达的WesternBlot检测(35℃条件下诱导表达)。1：诱导0小时；2：诱导1小时；3：诱导3小时；4：诱导5小时；5：诱导7小时；6：诱导8小时；7：诱导9小时；8：诱导10小时；9：标准品(10μg/mL)；10：预染蛋白质分子量标志物。图4A：HPV33L1蛋白的POROS50HS纯化电泳图。1：上柱样品；2：流穿液；3-5：不同浓度NaCl洗脱液；6：清洗液；7：蛋白质分子量标志物。B：HPV33L1蛋白的POROSXS纯化电泳图。1：上柱样品；2：流穿液；3-6：不同浓度NaCl洗脱液；7：清洗液；8：蛋白质分子量标志物。C：HPV33L1蛋白的CHT纯化电泳图。1：上柱样品；2：流穿液；3，4：不同浓度磷酸盐洗脱液；5：清洗液；6：蛋白质分子量标志物。图5纯化的HPV33L1蛋白的透射电镜观察结果。专利技术详述本专利技术人成功地建立了利用汉逊酵母产生HPV33L1蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产生表达人乳头瘤病毒33型L1(HPV33 L1)蛋白的重组汉逊酵母细胞的方法，其包含以下步骤：a)通过将包含编码HPV33 L1蛋白的核苷酸序列的外源多核苷酸插入载体来构建表达构建体；b)用步骤a)中获得的表达构建体转化汉逊酵母细胞；和c)对步骤b)中获得的汉逊酵母细胞进行筛选，获得含有所述外源多核苷酸的重组汉逊酵母细胞。

【技术特征摘要】
1.一种产生表达人乳头瘤病毒33型L1(HPV33L1)蛋白的重组汉逊酵母细胞的方法，其包含以下步骤：a)通过将包含编码HPV33L1蛋白的核苷酸序列的外源多核苷酸插入载体来构建表达构建体；b)用步骤a)中获得的表达构建体转化汉逊酵母细胞；和c)对步骤b)中获得的汉逊酵母细胞进行筛选，获得含有所述外源多核苷酸的重组汉逊酵母细胞。2.权利要求1的方法，其中所述HPV33L1蛋白的氨基酸序列示于SEQIDNO：1。3.权利要求2的方法，其中所述编码HPV33L1蛋白的核苷酸序列示于SEQIDNO：2。4.权利要求1-3中任一项的方法，其中在所述表达构建体中所述外源多核苷酸可操纵地连接于启动子和终止子。5.权利要求4的方法，其中所述启动子是MOX启动子。6.权利要求4或5的方法，其中所述终止子是MOX终止子。7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述载体包括SEQIDNO：9所示的核苷酸序列。8.权利要求7的方法，其中步骤c)中使用Zeocin和G418筛选重组汉逊酵母细胞。9.权利要求8的方法，其中Zeo...

【专利技术属性】
技术研发人员：王贻杰，程海，于跃，霍烛，刘娟，陈丹，李鼎锋，刘勇，
申请(专利权)人：北京安百胜生物科技有限公司，江苏瑞科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11