一种食用菌单倍体的无菌快速分离方法技术

本发明专利技术公开了一种食用菌单倍体的无菌快速分离方法，包括以下具体步骤：第一步，将菌丝置于液体培养基中培养得到成熟的菌丝体；第二步，制备染色菌丝液或染色原生质体悬浮液；第三步，确定二倍体和单倍体的分选参数，第四步，分选得到菌丝单倍体或原生质体单倍体。本发明专利技术优点在于克服了传统单倍体分选得率低、培育周期长的技术问题，本发明专利技术的整个培育过程可实现无菌分离，避免单倍体感染，同时培育周期短，分选得到的单倍体得率高，可直接作为杂交育种的原料，特别适用于平菇、香菇、木耳等二倍体食用菌的单倍体分离，为食用菌新品种的培育打下基础。

A Rapid Aseptic Separation Method for Haploid of Edible Fungi

【技术实现步骤摘要】
一种食用菌单倍体的无菌快速分离方法
本专利技术涉及食用菌育种技术，尤其是涉及一种食用菌单倍体的无菌快速分离方法。
技术介绍
食用菌味道鲜美、营养丰富、具有很高的食用价值，有“素中之荤”的美誉。随着民众生活水平的提高，民众对食用菌的消费需求日益增加，对食用菌种类的要求也越来越多样化，仅河南的食用菌栽培种类多达30多种。因而，目前急需研发选育新的食用菌品种以填补市场空白、满足市场发展需求、满足民众消费需求。食用菌育种技术主要有杂交育种、诱变育种、转基因育种等，杂交育种食用菌生产中最为快速有效、应用最多的育种方法，而在杂交育种中，获得大量单倍体是杂交育种的基础，现有食用菌单倍体的获取方式主要有单孢分离和原生质体分选，单孢分离包括孢子收集、多次梯度稀释、涂布、培养、挑选，鉴定等步骤后培育得到带细胞壁的单核菌丝（即菌丝单倍体），整个培育周期需要25天左右，耗时长且分选率低；原生质体分选包括菌丝体培养、制备原生质体、转接培养、人工挑取菌落后再生培养、镜检，最后得到不带细胞壁的单核原生质体（即原生质体单倍体），整个培育过程中人工挑取工作量大，挑取成功率小，使得再生培养后的单倍体得率仅为30%～60%，远远无法满足食用菌新品种的培育需求。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种食用菌单倍体的无菌快速分离方法，分离周期短，且单倍体收率高达90%以上，可以直接作为杂交育种材料。为实现上述目的，本专利技术采取下述技术方案：本专利技术所述的食用菌单倍体的无菌快速分离方法，包括以下具体步骤：第一步，将菌丝置于液体培养基中于25℃培养3～8天，无菌过滤得成熟的菌丝体；第二步，取第一步得到的菌丝体于无菌离心管内，加入研磨珠研磨30～120s；将研磨后的菌丝体进行处理得到染色菌丝液或染色原生质体悬浮液；第三步，将第二步得到的染色菌丝液或染色原生质体悬浮液用流式细胞仪进行倍性分析，找到有效的峰值区域，确定菌丝单倍体或原生质体单倍体的区域间阈值的M值，菌丝二倍体或原生质体二倍体的区域间阈值的M值，以及菌丝单倍体M值和菌丝二倍体M值的倍数关系或原生质体单倍体M值与原生质体二倍体M值的倍数关系；第四步，按照第三步中确定的菌丝单倍体M值和菌丝二倍体M值调整流式细胞仪的分选参数，利用流式细胞仪对第二步中的染色菌丝液进行分选，收集得到菌丝单倍体；或者按照第三步中确定的原生质体单倍体M值和原生质体二倍体M值调整流式细胞仪的分选参数，利用流式细胞仪对第二步中的染色原生质体悬浮液进行分选，收集得到原生质体单倍体。所述第二步中将菌丝体处理成染色菌丝液的具体方法为：三角瓶内加入裂解液，将研磨后的菌丝转移至三角瓶内裂解20～40min，过滤，滤液内加入DAPI染色剂染色10～20min，得到染色菌丝液。所述第二步中将菌丝体处理成染色原生质体悬浮液的具体方法为：三角瓶内加入酶解液，将研磨后的菌丝体转移至三角瓶内，酶解3～5h，过滤，依次用KCl溶液、STC溶液洗涤，再用STC溶液悬浮得到原生质体悬浮液，向原生质体悬浮液中加入DAPI染色剂染色10～20min得染色原生质体悬浮液。所述第二步菌丝体酶解时菌丝体的重量与酶解液的体积比为1:5～1:10。所述第二步中的酶解液为溶壁酶溶液，具体配制方法为：称取0.3g溶壁酶溶解在3mLN-buffer中，待溶壁酶完全溶解后用微孔过滤膜过滤除菌，向滤液中添加17mLP-buffer制得浓度为1.5%的酶解液。所述第二步中菌丝体的酶解温度为30～37℃。本专利技术优点在于克服了传统单倍体分选得率低、培育周期长的技术问题，本专利技术的整个培育过程可实现无菌分离，避免单倍体感染，且单倍体培育周期短，分选得到的单倍体得率高，可直接作为杂交育种的原料，特别适用于平菇、香菇、木耳等二倍体食用菌的单倍体分离，为食用菌新品种的培育打下基础。具体体现在以下两点：1）、本专利技术直接对裂解后的菌丝液进行分选得到带有细胞壁的菌丝单倍体，周期短，分离方法简单，菌丝单倍体中的单倍体含量在90%以上（即单倍体得率≥90%），可直接作为杂交育种的原料；2）、本专利技术对菌丝体进一步处理成原生质体悬浮液，将原生质体悬浮液分选得到没有细胞壁的单倍体，虽然分离方法相对复杂，但是单倍体分离效果更好，单倍体得率高达99%以上，能够直接用于杂交育种的原料。附图说明图1是本专利技术原生质体单倍体、二倍体的倍性关系图。图2是本专利技术原生质体单倍体中单倍体的分布图。图3是本专利技术不同浓度原生质体单倍体的再生萌发图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行更加详细的说明，其中所用实验试剂均为市售产品，本专利技术的平菇菌丝品种均为黑平16-1。实施例1本实施例以平菇菌丝为原材料，在无菌环境中将平菇菌丝培养成熟后利用流式细胞仪分选即可得到菌丝单倍体，具体包括以下步骤：第一步，将生长条件良好的平菇菌丝接种到PDA液体培养基中，然后于摇床（摇床速度为150rpm）内在25℃培养3～5天，用5层无菌擦镜纸过滤收集得到成熟的平菇菌丝体；第二步，取第一步得到的菌丝体于无菌离心管内，加入研磨珠机器研磨120s；三角瓶内加入裂解液，将研磨后的菌丝体转移至三角瓶内裂解20min，过滤，向滤液内加入DAPI染色剂染色10～20min得染色菌丝液；第三步，取第二步得到的染色菌丝液用流式细胞仪（流式细胞仪型号为CUBE8，倍性分析前先对流式细胞仪紫外消毒30min，再利用酒精对其上样口和出样口消毒）进行倍性分析，调节仪器的不同域值，找到有效的峰值区域，确定菌丝单倍体区域间阈值的M值和菌丝二倍体的区域间阈值的M值，菌丝单倍体的M值和菌丝二倍体的M值成倍数关系，结果见表1；表1菌丝体的倍性分析从表1可以看出，菌丝单倍体的M值和菌丝二倍体的M值成倍数关系，能够做倍性分析，且菌丝单倍体和菌丝二倍体显著分离；第四步，按照菌丝单倍体的M值和二倍体的M值设定流式细胞仪的分选参数，在流式细胞仪出样口处连接无菌试管，点击流式细胞仪的分选按钮对染色菌丝液进行分选，收集得到菌丝单倍体。本实施例第一步、第二步、第三步和第四步均在无菌条件下进行。对收集的菌丝单倍体进行倍性分析验证：用流式细胞仪对第三步中的菌丝单倍体进行倍性分析，圈定菌丝单倍体中的单倍体区域。结果表明，分选得到的菌丝单倍体中的单倍体区域≥90%，即单倍体的得率≥90%。因此，本实施例分选得到的菌丝单倍体可直接作为杂交育种的材料。实施例2本实施例以平菇菌丝原材料，先将平菇菌丝培养为成熟的菌丝体，再利用成熟的菌丝体制备原生质体，利用流式细胞仪对原生质体进行分选即可得到原生质体单倍体，具体包括以下步骤：第一步，将生长条件良好的平菇菌丝接种到PDA液体培养基中，然后于摇床（摇床速度为150rpm）内在25℃培养3～5天，用5层无菌擦镜纸过滤收集得到成熟的平菇菌丝体；在平菇菌丝体培养过程中，配制以下溶液：P-buffer（即0.6M缓冲渗稳剂）：称取39.35gMgSO4、1.76g柠檬酸三钠，用蒸馏水溶解后转移至200mL容量瓶内定容，定容后调节pH至5.5；N-buffer：称取9.11g（原为9.105g，统一小数点）山梨醇、0.74g柠檬酸三钠，用蒸馏水溶解后转移至50mL容量瓶内定容，定容后调节pH至5.8；STC溶液：称取18.21g山梨醇、二水合氯化钙，用80ml蒸馏水完全溶解后加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种食用菌单倍体的无菌快速分离方法，其特征在于：包括以下具体步骤：第一步，将菌丝置于液体培养基中于25℃培养3～8天，无菌过滤得成熟的菌丝体；第二步，取第一步得到的菌丝体于无菌离心管内，加入研磨珠研磨30～120s；将研磨后的菌丝体进行处理得到染色菌丝液或染色原生质体悬浮液；第三步，将第二步得到的染色菌丝液或染色原生质体悬浮液用流式细胞仪进行倍性分析，找到有效的峰值区域，确定菌丝单倍体或原生质体单倍体的区域间阈值的M值，菌丝二倍体或原生质体二倍体的区域间阈值的M值，菌丝单倍体M值和菌丝二倍体M值的倍数关系或原生质体单倍体M值与原生质体二倍体M值的倍数关系；第四步，按照第三步中确定的菌丝单倍体M值和菌丝二倍体M值调整流式细胞仪的分选参数，利用流式细胞仪对第二步中的染色菌丝液进行分选，收集得到菌丝单倍体；或者按照第三步中确定的原生质体单倍体M值和原生质体二倍体M值调整流式细胞仪的分选参数，利用流式细胞仪对第二步中的染色原生质体悬浮液进行分选，收集得到原生质体单倍体。

【技术特征摘要】
1.一种食用菌单倍体的无菌快速分离方法，其特征在于：包括以下具体步骤：第一步，将菌丝置于液体培养基中于25℃培养3～8天，无菌过滤得成熟的菌丝体；第二步，取第一步得到的菌丝体于无菌离心管内，加入研磨珠研磨30～120s；将研磨后的菌丝体进行处理得到染色菌丝液或染色原生质体悬浮液；第三步，将第二步得到的染色菌丝液或染色原生质体悬浮液用流式细胞仪进行倍性分析，找到有效的峰值区域，确定菌丝单倍体或原生质体单倍体的区域间阈值的M值，菌丝二倍体或原生质体二倍体的区域间阈值的M值，菌丝单倍体M值和菌丝二倍体M值的倍数关系或原生质体单倍体M值与原生质体二倍体M值的倍数关系；第四步，按照第三步中确定的菌丝单倍体M值和菌丝二倍体M值调整流式细胞仪的分选参数，利用流式细胞仪对第二步中的染色菌丝液进行分选，收集得到菌丝单倍体；或者按照第三步中确定的原生质体单倍体M值和原生质体二倍体M值调整流式细胞仪的分选参数，利用流式细胞仪对第二步中的染色原生质体悬浮液进行分选，收集得到原生质体单倍体。2.根据权利要求1所述食用菌单倍体的无菌快速分离方法，其特征在于：所述第二步中将菌丝体处理得到染色菌丝液的具体方法为...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔维丽，康源春，崔筱，袁瑞奇，刘芹，孔维威，张玉亭，李惠文，余丰秋，胡素娟，段亚魁，宋志波，韩玉娥，
申请(专利权)人：河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41