一种聚糖结合多肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种聚糖结合多肽及其制备方法和应用，属于生物制药领域。本发明专利技术多肽由22个氨基酸组成，其氨基酸序列SEQ ID No.1所示。本发明专利技术多肽利用固相化学合成法合成，产量高，工艺稳定，分子量为2448.8Da。本具有特异与聚糖链结合的活性，可用来设计与糖生物学研究的工具或用来设计相关药物制剂。

A Polysaccharide Binding Peptide and Its Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种聚糖结合多肽及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种多肽及其应用，特别涉及一种聚糖结合多肽及其制备方法和应用，属于生物制药领域。
技术介绍
聚糖是组成机体组织细胞的重要生物大分子之一。除了糖原在细胞内作为葡萄糖储存形式参与能量代谢外，聚糖常与蛋白质、或脂类以共价键结合，以糖蛋白或糖脂的形式分布于细胞表面。因其结构及细胞表面分布这一特征，聚糖具有非常重要的生物学功能，其主要作用是参与细胞表面事件，包括细胞与细胞外基质分子、细胞与细胞之间的识别结合以及对外环境的应答等。因此，聚糖的功能牵涉到机体的胚胎发育、神经发生、肿瘤的转移、免疫反应以及表面抗原如血型抗原的形成等。干预聚糖结构或合成将影响其功能。这也是目前研究聚糖功能或设计相应药物的理论基础。目前，干预或研究聚糖功能最常用的方法是通过基因敲除技术，抑制相应糖基转移酶的表达。但这一方式只能用来在体外研究聚糖的功能，以目前的技术，远不能应用于临床治疗。再一个方法就是寻找能与聚糖链特异结合的分子，以阻断聚糖链的功能。其中应用最多的是凝集素。凝集素是能与某种特异结构糖链识别结合的蛋白质或糖蛋白。但凝集素是来源于植物或动物的大分子，具有抗原性。另外凝集素具有凝集细胞活性，对机体是毒素，故只能做为糖生物学研究的工具，不能应用于临床治疗。因此，寻找无免疫原性，安全无毒性的、能与聚糖特异结合的分子是这一研究领域的重要内容。多肽(50个以下氨基酸组成的肽链)具有分子量小、低毒性、高活性、无免疫原性，容易制备等。但目前为止，尚没有发现能与聚糖特异性结合的多肽。
技术实现思路
在长期从事多肽结构及功能的经验基础上，经反复体外和体内实验，设计出一种能与聚糖特异性结合的多肽。体外实验证明，该多肽可与蛋白结合聚糖和脂结合聚糖特异的识别结合。体内实验安全无毒性。本专利技术的目的是基于多肽分子设计理论和固相化学合成技术，提供一种聚糖特异性结合的多肽。为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供了如下技术方案：本专利技术提供一种聚糖结合多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术多肽由22个氨基酸组成，分子量为2446.8Da。本专利技术还提供所述的多肽在制备干预聚糖结构或合成的药物中的应用。所述制剂可以为本专利技术所述的多肽，也可以为含有本专利技术多肽和其他药学上可允许的辅料的制剂。本专利技术还提供所述的聚糖结合多肽的制备方法，该多肽用固相化学合成法制备得到，包括以下步骤：(1)将Fmoc保护氨基酸在2-CL树脂上按预先设计的顺序从C端到N端逐个进行偶合并去除Fmoc保护基，得连接有树脂的多肽链；(2)将步骤(1)得到的多肽链中加入裂解液，在25～35℃温度下，反应2-4小时，抽滤，滤液经纯化得到多肽粗品；(3)步骤(2)得到的多肽粗品经纯化，得到多肽纯品。进一步地，在上述技术方案中，在步骤(1)中所述的将Fmoc保护氨基酸在2-CL-树脂上偶合并去除Fmoc保护基的方法为：称取1g2-CL树脂放入反应器中，加入10mLDCM，加入4mmolFmoc保护氨基酸和1mmolDIEA，用氮气鼓泡反应3h，然后加入1mL甲醇和1mLDIEA，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、DCM洗净，加入2-4mL哌啶去除Fmoc保护基，得连接有树脂的多肽链。进一步地，在上述技术方案中，步骤(2)中所述的裂解液为87.5％的TFA水溶液。进一步地，在上述技术方案中，步骤(2)中所述的滤液的纯化包括如下步骤：滤液中加入冰乙醚使多肽沉降出来，离心得到多肽粗品。进一步地，在上述技术方案中，步骤(3)中所述的纯化方法包括高效液相色谱法。对于上述获得的本专利技术的多肽纯品，用质谱仪检测该序列分子量的正确性。经体内外实验证明，该多肽可与蛋白结合聚糖和脂结合聚糖特异的识别结合。对机体安全无毒性。专利技术有益效果本专利技术公开一种由22个氨基酸组成的多肽，其特点是分子量小，是目前发现的第一个可与聚糖特异性结合的多肽。该多肽经与荧光、生物素或酶结合，可做为特异的分子探针，在聚糖生物学研究中，用来检测细胞糖链表达。因其分子量小，无免疫原性，安全无毒，可用来设计开发治疗相关疾病如抑制肿瘤转移、抑制病毒、调节免疫等的药物制剂。本专利技术的多肽已被证明可以有效地抑制多种不同组织来源的肿瘤细胞在体内的肺转移灶的形成。且安全，无毒副作用。附图说明图1为本专利技术多肽的HPLC检测图谱。图2为本专利技术多肽的质谱检测图谱。图3本专利技术多肽与细胞膜糖蛋白聚糖链识别结合(A：考马斯亮蓝染色图谱；B：本专利技术多肽结合显色图谱；其中，M：分子量标准；1：胞膜蛋白样品；2：胞浆蛋白样品)。图4本专利技术多肽与糖蛋白标准品结合(A：考马斯亮蓝染色图谱；B：糖蛋白染色试剂盒染色图谱；C：本专利技术多肽结合显色图谱；其中，1：糖蛋白标准品；2、3：非糖蛋白标准品)。图5本专利技术多肽与包被到硅胶小球上的鞘糖脂糖链结合(A：对照组；B：磷脂包被的硅胶小球；C：糖鞘脂包被的硅胶小球)。具体实施方式下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。本专利技术中所出现的缩略语的说明：2-CL树脂：二氯树脂、Fmoc：9-芴甲氧羰基、DMF：二甲基甲酰胺、DCM：二氯甲烷、HOBT：1-羟基苯并三唑、DIC：N,N-二异丙基碳二亚胺、DIEA：N,N-二异丙基乙胺吡啶、PIP：哌啶、TFA：三氟乙酸。实施例1制备本专利技术多肽以下制备多肽的2-CL树脂，Fmoc保护氨基酸及缩合试剂、裂解试剂均购买于国内生化试剂公司。1.1本专利技术多肽树脂的合成本专利技术多肽树脂为：Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tbu)-Phe-Ile-Ser(tbu)-Val-Leu-Gln(trt)-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Leu-Arg(Pbf)-Met-Gly-Ala-Tyr(tbu)-2-CL树脂。使用2-CL树脂为开始载体，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次与表1所示的保护氨基酸偶联，制得本专利技术多肽树脂。本实施例所使用的保护氨基酸从树脂起算第1至第22个氨基酸相对应的保护氨基酸如下表所示：表1.保护氨基酸1.2接入第22～1个氨基酸。1.2.1接入第22个氨基酸。制备从C端到N端逐个进行。称取1g二氯树脂放入反应器中，加入10mLDCM，加入4mmolFmoc-Tyr(tbu)(L型酪氨酸)和1mmol的DIEA；用氮气鼓泡反应3h。然后加入1mL甲醇，1mLDIEA，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、DCM洗净。加入2-4ml哌啶去除Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护基，洗净，茚三酮检测。1.2.2接入第21～1个氨基酸采用上述同样方法，依次接入表1中对应的第21～1个保护氨基酸，接完所有保护氨基酸后，即得到的Fmoc-多肽树脂，加入适量哌啶去除Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护基，过滤洗涤后，即得本专利技术多肽树脂。1.3本专利技术多肽粗品的制备向取得的多肽树脂中加入87.5％的TFA水溶液作为裂解试剂，温度控制30度，反应三个小时；然后抽滤得到液体，用冰乙醚沉降出来，氮气吹去大部分的溶剂后，向残液中倒人20mL无水乙醚，出现白色絮状沉淀，在4000rpm转速，5℃条件下离心5分钟，倒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种聚糖结合多肽，其特征在于，所述聚糖结合多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种聚糖结合多肽，其特征在于，所述聚糖结合多肽的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。2.权利要求1所述的聚糖结合多肽在制备干预聚糖功能或合成的药物中的应用。3.根据权利要求1所述的聚糖结合多肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法为固相化学合成，包括以下步骤：(1)将Fmoc保护氨基酸在2-CL树脂上按预先设计的顺序从C端到N端逐个进行偶合并去除Fmoc保护基，得连接有树脂的多肽链；(2)将步骤(1)得到的多肽链中加入裂解液，在25～35℃温度下，反应2-4小时，抽滤，滤液经纯化得到多肽粗品；(3)步骤(2)得到的多肽粗品经纯化，得到多肽纯品。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中将Fmoc保护氨基酸在2-CL...

【专利技术属性】
技术研发人员：马克里，黄晓华，马晓光，何欣，王聪聪，
申请(专利权)人：大连医科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21