用于动物胚胎碱基编辑的组合物和碱基编辑方法技术

本发明专利技术提供一种包含脱氨酶和靶特异性核酸酶的碱基编辑组合物、使用该碱基编辑组合物的碱基编辑方法，以及生产经遗传修饰动物的方法。该碱基编辑组合物在哺乳动物胚胎中具有碱基编辑活性。

Compositions and Base Editing Method for Animal Embryo Base Editing

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于动物胚胎碱基编辑的组合物和碱基编辑方法
本专利技术提供一种包含脱氨酶和靶特异性核酸酶的碱基编辑组合物，使用该碱基编辑组合物的碱基编辑方法，以及构建经遗传修饰动物的方法。
技术介绍
大多数人类遗传疾病是由单碱基取代或点突变，而不是基因组中的一些插入/缺失(插入缺失)或广泛的染色体重排引起的。由可编程核酸酶(诸如簇状规则间隔短回文重复(CRISPR)-Cas9或Cpf1系统)介导的基因组编辑能够对引起遗传疾病的遗传缺陷进行基因校正，但是在以靶特异性方式诱导单碱基取代方面存在技术困难。这是因为可编程核酸酶产生的大多数DNA双链断裂(DSB)通过易错非同源末端连接(NHEJ)而不是使用模板供体DNA的同源重组(HR)来修复。因此，核酸酶靶向位点的插入缺失比单核苷酸取代更频繁地发生。最近，据报道与胞苷脱氨酶(诸如载脂蛋白B编辑复合物1(APOBEC1)或活化诱导脱氨酶(AID))连接的Cas9切口酶(nCas9)或催化缺陷型Cas9(dCas9)在靶位点用C取代T(或用G取代A)，而不会产生DSB。这些报道显示了在酵母和经培养的哺乳动物细胞中的碱基编辑。这些RNA引导的可编程脱氨酶将基因组编辑的覆盖范围扩展到另一个水平，并且可能提出一种在包括人类在内的所有生物中诱导靶突变或进行基因编辑的方法。然而，必须证明RNA可编程脱氨酶在体内具有碱基编辑功能。
技术实现思路
技术问题本专利技术提供了通过使用可编程脱氨酶在诸如鼠细胞的真核细胞(例如，包括哺乳动物细胞的动物细胞)中诱导单核苷酸取代的技术。一个实施方案提供了碱基编辑组合物，其包含：(1)脱氨酶或其编码基因，和(2)靶特异性核酸酶或其编码基因。细胞可以是真核细胞(例如，来自真核动物的细胞)，并且碱基编辑方法可以在真核细胞中进行碱基编辑(例如，碱基取代)。靶特异性核酸酶可包括：RNA引导的核酸酶；以及可与靶基因或其编码DNA(或携带编码DNA的重组载体)中的靶位点杂交(具有互补核苷酸序列)的向导RNA。在这方面，碱基编辑组合物可包含：(1)脱氨酶或其编码基因(mRNA或携带编码DNA的重组载体)、(2)RNA引导的核酸酶或其编码基因(mRNA或携带编码DNA的重组载体)，和(3)向导RNA或其编码基因(DNA)。除了(1)脱氨酶或其编码基因(mRNA或携带编码DNA的重组载体)、(2)RNA引导的核酸酶或其编码基因(mRNA或携带编码DNA的重组载体)，和(3)向导RNA或其编码基因(DNA)之外，碱基编辑组合物可以进一步包含：(4)尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)或其编码基因；和/或(5)核定位序列(NLS)或其编码基因。在碱基编辑组合物使用脱氨酶、RNA引导的核酸酶和可选地UGI和/或NLS或其编码基因分别连接的融合蛋白或基因形式的情况下，可以在相邻的偶联蛋白质或基因之间给予合适的接头，例如，脱氨酶和RNA引导的核酸酶之间、核酸酶和UGI之间，以及UGI和NLS(融合蛋白的肽接头(3-30或3-20a.a.)和融合基因的寡核苷酸接头(9-90或9-60nt))。另一个实施方案提供了一种碱基编辑方法，包括将碱基编辑组合物引入细胞的步骤。细胞可以是真核细胞，并且碱基编辑方法可以在真核细胞中进行编辑(例如，碱基取代)。在一个实施方案中，将碱基编辑组合物引入细胞的步骤可以通过以下进行：1)通过分别携带这些基因或携带至少两个基因的重组载体将编码脱氨酶的DNA、编码RNA引导的核酸酶的DNA和编码向导RNA的基因转染到细胞中，2)将脱氨酶、RNA引导的核酸酶和向导RNA(例如，脱氨酶、RNA引导的核酸酶和向导RNA复合的核糖核酸蛋白)直接注射到细胞中，或者3)将编码脱氨酶的mRNA、编码RNA引导的核酸酶的mRNA和向导RNA直接注射到细胞中。如上所述，在通过1)、2)或3)进行的引入步骤中使用的碱基编辑组合物可以进一步包含尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)或其编码基因和/或(5)核定位序列(NLS)或其编码基因，以及可选地，合适的接头。另一个实施方案提供了经遗传修饰的细胞，其包含通过碱基编辑方法编辑的碱基。另一个实施方案提供了从经遗传修饰的细胞获得的经遗传修饰的动物。另一个实施方案提供了构建经遗传修饰动物的方法，该方法包括将哺乳动物胚胎移植到哺乳动物代孕母动物的输卵管中的步骤，该哺乳动物胚胎具有引入其中的碱基编辑组合物。技术方案本专利技术人通过使用可编程的脱氨酶成功地在真核细胞(诸如鼠细胞(例如动物细胞，如哺乳动物细胞等))中诱导单核苷酸取代。一个实施方案提供了碱基编辑组合物，其包含：(1)脱氨酶或其编码基因，和(2)靶特异性核酸酶或其编码基因。碱基编辑组合物可以在真核细胞中具有碱基编辑(例如，碱基取代)活性。真核细胞可以是真核动物的细胞，例如胚胎细胞。在一个实施方案中，真核细胞可以是哺乳动物细胞，例如哺乳动物胚胎细胞。如本文所用的，术语“编码基因”旨在包括cDNA、rDNA、携带cDNA、rDNA的重组载体和mRNA。如本文所用的，“脱氨酶”是具有从真核细胞中的某些碱基除去胺基的活性的酶的通用术语，并且可以是例如将胞苷转化为尿苷的胞苷脱氨酶，和/或腺苷脱氨酶。在一个实施方案中，脱氨酶可以是选自由下组成的组中至少一种：载脂蛋白B编辑复合物1(APOBEC1)、活化诱导的脱氨酶(AID)、tRNA特异性腺苷脱氨酶(tadA)等，但不限于此。真核细胞中的单核苷酸取代可以通过这种碱基转化(例如，胞苷转化为尿苷)诱导。靶特异性核酸酶可包括RNA引导的核酸酶和能够与靶基因或其编码DNA(或携带编码DNA的重组载体)的靶位点杂交(或具有互补序列)的向导RNA。在本文中，碱基编辑组合物可包含：(1)脱氨酶或其编码基因(mRNA或携带编码DNA的重组载体)、(2)经修饰的RNA引导的核酸酶或其编码基因(mRNA或携带编码DNA的重组载体)，和(3)向导RNA或其编码DNA。除了(1)脱氨酶或其编码基因(mRNA或携带编码DNA的重组载体)、(2)RNA引导的核酸酶或其编码基因(mRNA或携带编码DNA的重组载体)，和(3)向导RNA或其编码基因(DNA)之外，碱基编辑组合物可以进一步包含：(4)尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)或其编码基因；和/或(5)核定位序列(NLS)或其编码基因。在碱基编辑组合物使用脱氨酶、RNA引导的核酸酶和可选的UGI和/或NLS或其编码基因分别连接的融合蛋白或基因形式的情况下，可以在相邻的偶联蛋白质或基因之间给予合适的接头，例如，脱氨酶和RNA引导的核酸酶之间、核酸酶和UGI之间，以及UGI和NLS(融合蛋白的肽接头(3-30或3-20aa)和融合基因的寡核苷酸接头(9-90或9-60nt))。在一个实施方案中，RNA引导的核酸酶可以是经修饰的RNA引导的核酸酶，其被修饰以丧失形成DNA双链断裂的活性。经修饰的RNA引导的核酸酶可以是经修饰的Cas9(CRISPR相关蛋白9)或经修饰的Cpf1(来自普氏菌(Prevotella)和弗朗西斯氏菌(Francisella)1的CRISPR)系统，它们被修饰以切割靶基因中的一条链(切口形成)。在一个实施方案中，经修饰的RNA引导的核酸酶可以选自由Cas9切口酶(nCas9)和催化缺陷的Cas9(dCas9本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于哺乳动物细胞的碱基编辑组合物，所述组合物包含：胞苷脱氨酶或其编码基因；和靶特异性核酸酶或其编码基因。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.23 KR 10-2016-01784291.用于哺乳动物细胞的碱基编辑组合物，所述组合物包含：胞苷脱氨酶或其编码基因；和靶特异性核酸酶或其编码基因。2.权利要求1所述的碱基编辑组合物，其中，所述靶特异性核酸酶包括RNA引导的核酸酶和向导RNA。3.权利要求2所述的碱基编辑组合物，其中，所述RNA引导的核酸酶是Cas9蛋白或Cpf1蛋白。4.权利要求2所述的碱基编辑组合物，其中，所述RNA引导的核酸酶是Cas9切口酶、催化缺陷的Cas9蛋白，或识别不同于野生型Cas9蛋白的PAM序列的Cas9蛋白。5.权利要求4所述的碱基编辑组合物，其中，所述RNA引导的核酸酶包含酿脓链球菌来源的Cas9蛋白的氨基酸序列，其中下列氨基酸残基被不同于野生型氨基酸残基的氨基酸残基取代：(1)D10、H840、或D10和H840；(2)选自由D1135、R1335、T1337组成的组中至少一种；或者(3)(1)和(2)氨基酸残基。6.权利要求2所述的碱基编辑组合物，其中，所述向导RNA是所述单向导RNA包含CRISPRRNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)双RNA或单向导RNA(sgRNA)，。7.权利要求1所述的碱基编辑组合物，其中，所述胞苷脱氨酶是APOBEC(载脂蛋白BmRNA编辑酶，催化多肽样)、AID(活化诱导的胞苷脱氨酶)、tadA(tRNA特异性腺苷脱氨酶)，或其组合。8.权利要求2至7中任一项所述的碱基编辑组合物，其中，所述用于哺乳动物细胞的碱基编辑组合物包含编码胞苷脱氨酶的mRNA、编码RNA引导的核酸酶的mRNA，和向导RNA。9.权利要求2至7中任一项所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：金晋秀，金敬美，柳锡玟，
申请(专利权)人：基础科学研究院，
类型：发明
国别省市：韩国,KR