【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】糖的无细胞生产相关申请本申请要求2017年1月6日提交的美国临时申请U.S.S.N.62/443,447和2017年7月28日提交的U.S.S.N.62/538,181的35U.S.C.§119(e)下的优先权，每篇通过引用整体并入本文。专利技术背景用于将淀粉转化为单糖的现有的技术采用多种生物转化反应，在每次生物转化后具有广泛的纯化过程。虽然生物转化过程相对便宜，但由于固定化酶和连续生产系统的应用，下游加工显著影响成本。专利技术概述本文中提供了用于将聚合葡萄糖酶促转化为戊糖(例如核糖、阿拉伯糖或木酮糖)或己糖(例如阿洛酮糖，葡萄糖或果糖)糖类的无细胞系统、方法、组合物和试剂盒，所述聚合葡萄糖如淀粉(例如直链淀粉和/或支链淀粉)、糖原或其任何部分水解的衍生物，如麦芽糖糊精或纤维糊精(其可以与术语纤维素可互换使用)。本公开的方法在无细胞反应(例如，一锅(单)无细胞反应)中实施糖生产途径，以将淀粉和/或纤维素/纤维糊精转化为己糖和/或戊糖。与通常涉及将底物诸如葡萄糖磷酸化为葡萄糖6-磷酸并使用高能磷酸盐源如ATP和磷烯酰基丙酮酸的方法不同，本文所述的方法通常用例如便宜的无机磷酸盐(Pi)替换高能磷酸盐源。在一些实施方案中，使用α-葡聚糖磷酸化酶(也称为淀粉磷酸化酶)(EC2.4.1.1)将淀粉转化为葡萄糖1-磷酸，然后通过葡糖磷酸变位酶(EC5.4.2.2、5.4.2.5或5.4.2.6)将所述葡萄糖1-磷酸转化为葡萄糖6-磷酸。在其他实施方案中，使用纤维糊精磷酸化酶(也称为纤维素磷酸化酶或β-(1-4)葡聚糖磷酸化酶)(EC2.4.1.49)将纤维素/纤维糊精转...
【技术保护点】
1.生产阿洛酮糖化合物的方法，其包括以下步骤：由α‑葡聚糖磷酸化酶或纤维糊精磷酸化酶催化的将聚合葡萄糖碳水化合物转化为葡萄糖1‑磷酸(G1P)；由葡糖磷酸变位酶催化的转化所述葡萄糖1‑磷酸(G1P)以产生葡萄糖‑6‑磷酸(G6P)；由葡糖磷酸异构酶催化的将所述葡萄糖6‑磷酸(G6P)转化为果糖6‑磷酸(F6P)；由阿洛酮糖6‑磷酸差向异构酶(A6PE)催化的转化所述果糖6‑磷酸(F6P)以产生阿洛酮糖6‑磷酸(A6P)；以及由阿洛酮糖6‑磷酸磷酸酶(A6PP)催化的将所述阿洛酮糖6‑磷酸差向异构酶(A6P)转化为阿洛酮糖。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.01.06 US 62/443,447;2017.07.28 US 62/538,1811.生产阿洛酮糖化合物的方法，其包括以下步骤：由α-葡聚糖磷酸化酶或纤维糊精磷酸化酶催化的将聚合葡萄糖碳水化合物转化为葡萄糖1-磷酸(G1P)；由葡糖磷酸变位酶催化的转化所述葡萄糖1-磷酸(G1P)以产生葡萄糖-6-磷酸(G6P)；由葡糖磷酸异构酶催化的将所述葡萄糖6-磷酸(G6P)转化为果糖6-磷酸(F6P)；由阿洛酮糖6-磷酸差向异构酶(A6PE)催化的转化所述果糖6-磷酸(F6P)以产生阿洛酮糖6-磷酸(A6P)；以及由阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶(A6PP)催化的将所述阿洛酮糖6-磷酸差向异构酶(A6P)转化为阿洛酮糖。2.权利要求1的方法，其中所述聚合葡萄糖碳水化合物是淀粉、纤维糊精或糖原。3.权利要求1或2的方法，其中所述α-葡聚糖磷酸化酶选自下组：风产液菌(Aquifexaeolicus)、密涅瓦热发状菌(Thermocrinisminervae)、高井热硫化物杆菌(Thermosulfidibactertakaii)、歧化热硫单胞菌(Thermosulfurimonasdismutans)、海滨热球菌(Thermococcuslitoralis)、太平洋古球菌(Palaeococcuspacificus)、新阿波罗栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)、热纤瘤胃梭菌(Ruminiclostridiumthermocellum)、深渊焦球菌(Pyrococcusabyssi)、硫还原热球菌(Thermococcusthioreducens)、耐辐射异常球菌(Deinococcusradiodurans)、酸热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius)、嗜热栖热菌(Thermuscaldophilus)、西尔瓦诺斯亚栖热菌(Meiothermussilvanus)、深海洋栖热菌(Oceanithermusprofundus)、Ardenticatenamaritima、嗜压热球菌(Thermococcusbarophilus)、Pseudothermotogathermarum、嗜热氢杆菌(Hydrogenobacterthermophilus)、大岛栖热菌(Thermusoshimai)、红色亚栖热菌(Meiothermusruber)和嗜压海袍菌(Marinitogapiezophila)α-葡聚糖磷酸化酶。4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述纤维糊精磷酸化酶选自下组：热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)、斯特米尼斯梭菌(Clostridiumstraminisolvens)、栖热袍菌(Thermotoga)RQ2；聚集燃球形菌(Ignisphaeraaggregans)、海栖热袍菌(Thermotogamaritima)、嗜热螺旋体(Spirochaetathermophila)、Caldicellulosiruptorbescii、嗜热网团菌(Dictyoglomusthermophilum)、热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum)、非洲栖热腔菌(Thermosiphoafricanus)、Caldisalinibacterkiritimatiensis、Defluviitaleaphaphyphila、Caldicellulosiruptorkronotskyensis、西伯利亚热球菌(Thermococcussibiricus)和聚集热球形菌(Thermosphaeraaggregans)纤维糊精磷酸化酶。5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述葡糖磷酸变位酶选自下组：Thermococcuskodakaraensis、Pyrococcuskukulkanii、Ammonifexdegensii、沃氏甲烷嗜热杆菌(Methanothermobacterwolfeii)、炽热甲烷嗜热菌(Methanothermusfervidus)、酸热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius)、闪烁古球菌(Archaeoglobusfulgidus)、Ferroglobusplacidus，Geoglobusahangari、产毒古球菌(Archaeoglobusveneficus)、Archaeoglobussulfaticallidus、Aciduliprofundumboonie、热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)、Defluviitaleaphaphyphila、Caminicellasporogenes、Caloranaerobacterferrireducens、Thermosiphomalanesiensis、Fervidobacteriumpennivorans、嗜热共生菌(Symbiobacteriumthermophilum)、嗜热螺旋体(Spirochaetathermophila)和威吉利热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterwiegelii)葡糖磷酸变位酶。6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述葡糖磷酸异构酶选自：嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)、白色亚栖热菌(Meiothermustimidus)、丝状栖热菌(Thermusfiliformis)、热水海栖热菌(Marinithermushydrothermalis)、非洲栖热腔菌(Thermosiphoafricanus)、Sulfurihydrogenibiumazorense、Persephonellamarina、嗜压海袍菌(Marinitogapiezophila)、Kosmotogaolearia、海栖热袍菌(Thermotogamaritima)、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)、好热黄无氧芽孢菌(Anoxybacillusflavithermus)、高井热硫化物杆菌(Thermosulfidibactertakaii)、结节闪烁杆菌(Fervidobacteriumnodosum)、热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)、热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum)、詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)、Methanotorrisigneus、毛状甲烷暖球菌(Methanocaldococcusvillosus)、冲绳甲烷球菌(Methanothermococcusokinawensis)、温泉假热袍菌(Pseudothermotogathermarum)、脱硫铁还原杆菌(Deferribacterdesulfuricans)和Thermovibrioammonificans葡糖磷酸异构酶。7.权利要求1-6中任一项的方法、其中所述阿洛酮糖6-磷酸差向异构酶选自下组：热解糖嗜热杆菌(Thermobacteriumthermosaccharolyticum)、布氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterbrockii)、地下嗜热厌氧菌(Caldanaerobactersubterraneus)、脱硫铁还原杆菌(Deferribacterdesulfuricans)、红色热发状菌(Thermocrinisruber)、Hydrogenivirga种128-5-R1-1、热红短芽孢杆菌(Brevibacillusthermoruber)、大西洋栖热腔菌(Thermosiphoatlanticus)和高井热硫化物杆菌(Thermosulfidibactertakaii)阿洛酮糖6-磷酸差向异构酶。8.权利要求1-7中任一项的方法、其中所述阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶选自下组：威吉利热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterwiegelii)、产乙醇热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterethanolicus)、岛栖热菌(Thermusislandicus)、地热异常球菌(Deinococcusgeothermalis)DSM11300、聚集热球形菌(Thermosphaeraaggregans)、古细菌泉古菌(Crenarchaeotaarchaeon)、掘越氏焦球菌(Pyrococcushorikoshii)Ot3、风产液菌(Aquifexaeolicus)、热纤瘤胃梭菌(Ruminiclostridiumthermocellum)、库氏脱硫肠状菌(Desulfotomaculumkuznetsovii)、地下嗜热厌氧菌(Caldanaerobactersubterraneus)、解纤维酸热菌(Acidothermuscellulolyticus)、热自养甲烷热杆菌(Methanothermobacterthermautotrophicus)、褐色嗜热裂孢菌(Thermobifidafusca)、新阿波罗栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)、移动石袍菌(Petrotogamobilis)、和印度热脱硫杆菌(Thermodesulfatatorindicus)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)、普通拟杆菌(Bacteroidesvulgatus)以及脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilus)阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶。9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶特异于阿洛酮糖6-磷酸。10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述酶中至少一种是热稳定的或所述酶中至少两种是热稳定的。11.权利要求2-10中任一项的方法，其中用α-淀粉酶和脱支酶预处理所述淀粉或糖原以产生脱支的麦芽糖糊精。12.权利要求11的方法，其中所述脱支酶选自异淀粉酶和支链淀粉酶。13.权利要求12的方法，其中所述异淀粉酶选自东工大硫化叶菌(Sulfolobustokodaii)、箱根生金球形菌(Metallosphaerahakonensis)、嗜热球形杆菌(Sphaerobacterthermophiles)和迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)异淀粉酶。14.权利要求12或13的方法，其中所述支链淀粉酶选自Fervidobacteriumpennavorans、栖热袍菌种RQ5、黄热芽孢杆菌(Bacillusflavocaldarius)、非洲栖热腔菌和Kosmotogaolearia支链淀粉酶。15.生产阿洛酮糖的无细胞方法，所述方法包括：(a)培养经工程化改造以表达热稳定性α-葡聚糖磷酸化酶、热稳定性葡糖磷酸变位酶、热稳定性葡糖磷酸异构酶、热稳定性阿洛酮糖6-磷酸差向异构酶和热稳定性阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶的细胞以产生表达所述热稳定性酶的培养细胞；(b)裂解所述培养细胞以产生细胞裂解物；(c)将所述细胞裂解物加热至使天然酶活性失活但不使步骤(a)的所述热稳定性酶失活的温度以产生经热失活的裂解物；并且(d)在存在淀粉、糖原或其任何部分水解的衍生物和无机磷酸盐的情况下温育所述经热失活的裂解物以产生阿洛酮糖。16.权利要求15的无细胞方法，其中用α-淀粉酶和脱支酶预处理所述淀粉或糖原以产生脱支的麦芽糖糊精。17.权利要求15的无细胞方法，其中用α-淀粉酶预处理所述淀粉或糖原以产生支链麦芽糖糊精，并将脱支酶添加至步骤(d)。18.权利要求15的无细胞方法，其中将脱支酶添加至步骤(d)。19.权利要求16-18中任一项的无细胞方法，其中所述脱支酶选自异淀粉酶和支链淀粉酶。20.权利要求19的无细胞方法，其中所述异淀粉酶选自东工大硫化叶菌、箱根生金球形菌、嗜热球形杆菌和迟缓芽孢杆菌异淀粉酶。21.权利要求19或20的无细胞方法，其中所述支链淀粉酶选自Fervidobacteriumpennavorans、栖热袍菌种RQ5、黄热芽孢杆菌、非洲栖热腔菌和Kosmotogaolearia支链淀粉酶。22.生产阿洛酮糖的无细胞方法，所述方法包括：(a)培养至少两种细胞群体，其中每种群体的细胞经工程化改造以表达至少一种选自热稳定性α-葡聚糖磷酸化酶、热稳定性葡糖磷酸变位酶、热稳定性葡糖磷酸异构酶、热稳定性阿洛酮糖6-磷酸差向异构酶和热稳定性阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶的酶以产生至少两种表达不同酶的培养细胞群体；(b)裂解所述至少两种培养群体的细胞以产生至少两种细胞裂解物；(c)将所述至少两种细胞裂解物组合以产生细胞裂解物混合物，其包含热稳定性α-葡聚糖磷酸化酶、热稳定性葡糖磷酸变位酶、热稳定性葡糖磷酸异构酶、热稳定性阿洛酮糖6-磷酸差向异构酶和热稳定性阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶；(d)将所述细胞裂解物混合物加热至使天然酶活性失活但不使步骤(c)的热稳定性酶失活的温度以产生经热失活的裂解物；并且(e)在存在淀粉、糖原或其任何部分水解的衍生物和无机磷酸盐的情况下温育所述反应混合物以产生阿洛酮糖。23.生产阿洛酮糖的无细胞方法，所述方法包括：(a)培养至少两种细胞群体，其中每种群体的细胞经工程化改造以表达至少一种选自α-葡聚糖磷酸化酶、葡糖磷酸变位酶、葡糖磷酸异构酶、阿洛酮糖6-磷酸差向异构酶和阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶的酶，以产生至少两种表达不同酶的培养细胞群体，其中前述酶中的至少一种是热稳定的；(b)裂解所述至少两种培养群体的细胞以产生至少两种细胞裂解物；(c)任选地将步骤(b)的细胞裂解物中的一种或多种加热至使天然酶活性失活但不使步骤(a)的热稳定性酶失活的温度，以产生经热失活的裂解物；(d)将步骤(b)和(c)的细胞裂解物组合以产生细胞裂解物混合物，其包含α-葡聚糖磷酸化酶、葡糖磷酸变位酶、葡糖磷酸异构酶、阿洛酮糖6-磷酸差向异构酶和阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶，其中前述酶中的至少一种是热稳定的；并且(e)在存在淀粉、糖原或其任何部分水解的衍生物和无机磷酸盐的情况下温育所述细胞裂解物混合物以产生阿洛酮糖。24.生产阿洛酮糖的无细胞方法，所述方法包括：(a)培养至少两种细胞群体，其中每种群体的细胞经工程化改造以表达至少一种选自热稳定性α-葡聚糖磷酸化酶、热稳定性葡糖磷酸变位酶、热稳定性葡糖磷酸异构酶、热稳定性阿洛酮糖6-磷酸差向异构酶和热稳定性阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶的酶，以产生至少两种表达不同酶的培养细胞群体；(b)裂解所述至少两种培养群体的细胞以产生至少两种细胞裂解物；(c)将所述至少两种细胞裂解物组合以产生细胞裂解物混合物；(d)将所述细胞裂解物混合物加热至使天然酶活性失活但不使步骤(a)的热稳定性酶失活的温度以产生经热失活的裂解物；(e)对所述经热失活的裂解物添加至少一种选自α-葡聚糖磷酸化酶、葡糖磷酸变位酶、葡糖磷酸异构酶、阿洛酮糖6-磷酸差向异构酶和阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶的纯化酶，以产生包含α-葡聚糖磷酸化酶、葡糖磷酸变位酶、葡糖磷酸异构酶、阿洛酮糖6-磷酸差向异构酶和阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶的反应混合物；并且(f)在存在淀粉、糖原或其任何部分水解的衍生物和无机磷酸盐的情况下温育所述反应混合物以产生阿洛酮糖。25.生产阿洛酮糖的无细胞方法，所述方法包括：(a)培养至少两种细胞群体，其中每种群体的细胞经工程化改造以表达至少一种选自α-葡聚糖磷酸化酶、葡糖磷酸变位酶、葡糖磷酸异构酶、阿洛酮糖6-磷酸差向异构酶和阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶的酶，以产生至少两种表达不同酶的培养细胞群体，其中前述酶中至少一种是热稳定的；(b)裂解所述至少两种培养群体的细胞以产生至...
【专利技术属性】
技术研发人员：DS坎宁安，D麦凯克伦，ME穆拉，WJ布莱克，
申请(专利权)人：绿光生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US
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