一种生物芯片的抗体高效固定方法技术

本发明专利技术提供了一种生物芯片的抗体高效固定方法，包括如下步骤：步骤1、生物芯片表面活化处理；步骤2、3D微结构构建；步骤3、偶联层接枝；步骤4、抗体共价固定；步骤5、封闭洗脱。本发明专利技术所述的方法解决了现存的聚合物芯片抗体固定技术存在的问题。该方法制备简单，成本低，适合于工业化生产。所得生物芯片具备抗体固定效率高、均一性好、背景低、信噪比高的特点，可应用于多种体外检测生物芯片载体。

An Efficient Immobilization Method for Antibody of Biochip

【技术实现步骤摘要】
一种生物芯片的抗体高效固定方法
本专利技术属于生物
，尤其是涉及一种生物芯片的抗体高效固定方法，适用于抗体、蛋白、核酸等的固定，可直接应用于体外检测生物芯片的制作。
技术介绍
生物芯片技术作为体外快速诊断中的前沿技术，可实现微型化、集成化、自动化的快速分析和检测。由于在样本用量、样本种类、试剂便利性、操作者要求等方面上都具有巨大优势，广泛应用于重症监护室、手术、急诊、患者家中及慢性病监测。在体外检测的应用中，生物芯片能够进行绝大多数常规临床指标的检测。而芯片是检测的基础，其制备生物芯片是产品开发中十分重要的环节。生物芯片一般选择经过相应处理的硅、玻璃、聚合物、金属等材料作为载体。聚合物材料由于价格低廉，种类多，加工性能好，可批量加工，并具有良好的生物兼容性等优点被广泛应用。生物芯片制备过程中的一个重要环节是抗体等在芯片表面的固定，其在芯片基底表面的吸附量和稳定性是影响芯片检测信号精准度的关键，也是决定芯片质量的核心。目前常用的抗体固定方法有物理吸附和共价接枝两种。物理吸附是利用抗体与基底之间的范德华力、静电作用、极性相互作用或疏水性相互作用力将抗体固定在载体表面。但是此种抗体固定方法缺少强的、特异性的结合，易存在吸附不均匀、易脱落、重现性差的问题，特别是在生物通道中导致载体与抗体动态结合不牢固，检测下限低，稳定性差。化学接枝是通过修饰的载体表面与蛋白质侧链官能团(侧基)之间的共价键作用将抗体牢固的固定在芯片表面，常用的修饰方法有氨基修饰、羧基修饰、醛基修饰、环氧基修饰等。此种抗体固定方法是在基底表面自组装一层均匀的官能团通过不可逆共价结合产生一个高的表面覆盖度。但单层分子的链接使得空间位阻较大，非特异性吸附较高，点样均一性低，结合力较差，信号强度不高，稳定性差，难以满足体外检测所要求的高灵敏度、高信噪比、低检测限的要求。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术旨在提出一种生物芯片的抗体高效固定方法，解决了现存的聚合物芯片抗体固定技术存在的问题。该方法制备简单，成本低，适合于工业化生产。所得生物芯片具备抗体固定效率高、均一性好、背景低、信噪比高的特点，可应用于多种体外检测生物芯片载体。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种生物芯片的抗体高效固定方法，包括如下步骤：步骤1、生物芯片表面活化处理；步骤2、3D微结构构建：将生物芯片置于多功能基团聚合物的溶液中进行液相处理，在芯片表面自组装成具有多个活性位点的3D微结构；步骤3、偶联层接枝：选用硅烷化试剂溶液或醛基基团供体溶液对芯片表面相应基团进行接枝；步骤4、抗体共价固定；步骤5、封闭洗脱。进一步的，所述多功能基团聚合物包括多氨基聚合物、多羟基聚合物或多羧基聚合物。优选地，所述多氨基聚合物为壳聚糖或聚乙二胺，所述多羟基聚合物为聚乙二醇，所述多羧基聚合物为聚丙烯酸。更优选地，所述多功能基团聚合物为壳聚糖，所述多功能基团聚合物的溶液为壳聚糖醋酸溶液；进一步的，所述壳聚糖醋酸溶液的浓度为0.1-5mg/mL,优选为0.1-3mg/mL；优选地，所述壳聚糖醋酸溶液中醋酸的体积分数为0.1-10％，更优选为0.1-5％；优选地，所述醋酸溶液的液相处理的温度为20-60℃，优选为25-37℃。优选地，所述壳聚糖溶液的液相处理时间为10-120min，优选为20-60min。进一步的，所述步骤1的生物芯片表面活化处理为UV辐射处理、等离子体处理、臭氧处理、电晕处理、强酸处理或强碱处理。优选地，所述步骤1的生物芯片表面活化处理为等离子体活化处理。进一步的，所述等离子体处理的气氛为空气、氧气、氮气、氩气的一种或两种以上的混合气体。进一步的，所述等离子体的处理时间为0.5-20min，等离子体的气体流量为200-1500mL/min，等离子体发生功率为50-300w。进一步的，所述步骤3中的硅烷化溶液中溶质为3-氨丙基三乙氧基硅烷、二氯二甲基硅烷、3-[(2,3)-环氧丙氧]丙基甲基二甲氧基硅烷、三甲基氯硅烷或六甲基二硅氨烷中一种或两种以上的混合物，溶剂为水或乙醇。进一步的，所述硅烷化溶液的体积分数为1-10％。进一步的，所述的硅烷化溶液接枝过程的温度为20-60℃；时间为10-120min。进一步的，所述步骤3还包括偶联层接枝后的烘干步骤，所述烘干的温度为37-90℃；所述烘干的时间为15-60min。进一步的，所述步骤3的偶联层接枝中醛基基团供体溶液中的溶质为戊二醛、乙二醛、对苯二甲醛中的任意一种或者至少两种的组合，优选为戊二醛溶液；进一步的，所述戊二醛溶液为戊二醛的水溶液或乙醇溶液，优选为戊二醛的水溶液；进一步的，所述戊二醛溶液的体积分数为0.5％-20％，优选为1％-10％；进一步的，所述戊二醛溶液进行接枝过程的温度为20-60℃，优选为25-37℃；进一步的，所述戊二醛溶液进行接枝过程的时间为10-120min，优选为20-60min。进一步的，所述步骤4的抗体共价固定的具体步骤为：使用生物芯片点样仪将配置好的抗体试剂喷点在检测区域相应位置后进行孵育，完成抗体的共价固定。进一步的，所述孵育的温度为20-40℃，优选为20-37℃；所述孵育的湿度为40-80％，优选为60-80％；所述孵育的时间为1-10h，优选为1-5h。进一步的，所述步骤5封闭洗脱的具体步骤为：先用BSA溶液对基片表面抗体和未反应的活性位点封闭0.5-2h，然后分别用PBST和纯化水进行清洗3遍，氮气吹干。进一步的，所述BSA溶液的质量浓度为0.5-5％，优选为1-3％；所述封闭时间为0.5-2h，优选为0.5-1h。进一步的，所述PBST溶液的体积分数为0.05-0.5％。进一步的，所述生物芯片的材料包括但不限于聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)。进一步的，在所述的步骤1之前先将生物芯片先进行超声清洗吹干。本专利技术还包括通过上述方法制备而得的生物芯片。相对于现有技术，本专利技术所述的生物芯片的抗体高效固定方法具有以下优势：(1)使用本专利技术的方法制得的生物芯片中3D微结构构造三维形貌，比表面积大，有效增加了基团与抗体分子的接触面积；(2)使用本专利技术的方法制得的生物芯片中所构造三维形貌同时具备多个活性位点，与单层修饰相比实现高的靶分子结合位点，增加了捕获区捕获容量，提高捕获效率；(3)使用本专利技术的方法制得的生物芯片中偶联层与抗体通过共价键牢固结合，解决了吸附不牢固的问题，避免清洗引起的抗体脱落，芯片表面光滑，干扰物质清洗彻底。附图说明构成本专利技术的一部分的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1基片经表面活化-壳聚糖-GA修饰后接枝抗体示意图；图2基片经表面活化-壳聚糖修饰后接枝抗体示意图；图3基片经表面活化-APTES-GA修饰后接枝抗体示意图；图4基片经表面活化-APTES修饰后接枝抗体示意图；图5基片经表面活化-壳聚糖-GA修饰后接枝抗体后的AFM表征；图6基片经表面活化-APTES-GA修饰后接枝抗体后的AFM表征。具体实施方式除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本专利技术所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物芯片的抗体固定方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1、生物芯片表面活化处理；步骤2、3D微结构构建：将生物芯片置于多功能基团聚合物的溶液中进行液相处理，在芯片表面自组装成具有多个活性位点的3D微结构；步骤3、偶联层接枝：选用硅烷化试剂溶液或醛基基团供体溶液对芯片表面相应基团进行接枝；步骤4、抗体共价固定；步骤5、封闭洗脱。

【技术特征摘要】
1.一种生物芯片的抗体固定方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1、生物芯片表面活化处理；步骤2、3D微结构构建：将生物芯片置于多功能基团聚合物的溶液中进行液相处理，在芯片表面自组装成具有多个活性位点的3D微结构；步骤3、偶联层接枝：选用硅烷化试剂溶液或醛基基团供体溶液对芯片表面相应基团进行接枝；步骤4、抗体共价固定；步骤5、封闭洗脱。2.根据权利要求1所述的生物芯片的抗体固定方法，其特征在于：所述多功能基团聚合物包括多氨基聚合物，优选地，所述多氨基聚合物为壳聚糖或聚乙二胺，更优选地，所述多功能基团聚合物为壳聚糖，所述多功能基团聚合物的溶液为壳聚糖醋酸溶液。3.根据权利要求1所述的生物芯片的抗体固定方法，其特征在于：所述多功能基团聚合物包括多羟基聚合物或多羧基聚合物；优选地，多羟基聚合物为聚乙二醇，所述多羧基聚合物为聚丙烯酸。4.根据权利要求2所述的生物芯片的抗体固定方法，其特征在于：所述壳聚糖醋酸溶液的浓度为0.1-5mg/mL，优选为0.1-3mg/mL；所述壳聚糖醋酸溶液中醋酸的体积分数为0.1-10％，更优选为0.1-5％；优选地，所述醋酸溶液的液相处理的温度为20-60℃，优选为25-37℃；优选地，所述壳聚糖溶液的液相处理时间为10-120min，优选为20-60min。5.根据权利要求1所述的生物芯片的抗体固定方法，其特征在于：所述步骤1的生物芯片表面活化处理为UV辐射处理、等离子体处理、臭氧处理、电晕处理、强酸处理或强碱处理；优选地，所述步骤1的生物芯片表面活化处理为等离子体活化处理；优选地，所述等离子体活化处理的气氛为空气、氧气、氮气、氩气的一种或两种以上的混合气体；优选地，所述等离子体的处理时间为0.5-20min，等离子体的气体流量为200-1500mL/min，等离子体发生功率为50-300w。6.根据权利要求2所述的生物芯片的抗体固定方法，其特征在于：所述步骤3的偶联层接枝中醛基基团供体溶液中的溶质为戊二醛、...

【专利技术属性】
技术研发人员：李勇，索轶平，徐涛，
申请(专利权)人：清华大学天津高端装备研究院，清华大学，
类型：发明
国别省市：天津,12