利用Gateway技术构建TYLCV和ToCV的双价RNAi表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种利用Gateway技术构建TYLCV和ToCV的双价RNAi表达载体及其应用。其中的双价RNAi表达载体，命名为pRNAi‑TOCV‑TY。所述RNAi表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。本发明专利技术利用RNAi技术进行了大量的研究工作，通过Gateway技术，构建了TYLCV和ToCV的外壳蛋白基因双价RNAｉ表达载体，通过遗传转化、抗性鉴定等实验方法获得了抗两种病毒的转基因番茄植株。本发明专利技术进一步公开了pRNAi‑TOCV‑TY表达载体在有效防治ToCV和TYLCV的复合侵染番茄方面的应用。特别是pRNAi‑TOCV‑TY表达载体有效阻碍番茄病毒在植株体内的复制方面的应用。

Construction of Bivalent RNAi Expression Vectors of TYLCV and ToCV by Gateway Technology and Their Application

【技术实现步骤摘要】
利用Gateway技术构建TYLCV和ToCV的双价RNAi表达载体及其应用
本专利技术提供一种利用Gateway技术快速、简捷地构建抗TYLCV和ToCV病毒双价RNAi表达载体，并用于抑制这两种病毒的侵染，从而培育出双抗的植物新材料。属基因工程

技术介绍
番茄（LycopersiconesculentumMill.）是我国设施栽培的主要蔬菜作物之一，在蔬菜周年供应上占有重要地位。但随着番茄种植面积的日趋扩大和引种渠道的多样化，番茄病毒病也日益严重，成为制约番茄发展的瓶颈。目前，番茄褪绿病毒（Tomatochlorosisvirus,ToCV）和番茄黄化曲叶病毒（Tomatoyellowleafcurlvirus,TYLCV）对番茄危害最为严重，且经常出现复合侵染的情况，加重病症，造成产量和质量的严重下降。目前，对番茄黄化曲叶病毒主要是利用野生抗性资源培育抗病品种。而这种方法对番茄褪绿病毒却无能为力，因为到目前为止，在世界范围内还未找到对这一病毒的抗性基因。所以培育抗番茄褪绿病毒已成为亟待解决的难题。近年来，利用RNAi沉默技术作为一种抵抗外来基因入侵的防御方式成为基因工程抗病育种中的最为有效的一种方法。构建植物RNAi表达载体的方法基本分为两种,一种为以酶切连接为基础的传统的植物RNAi表达载体构建；另一种以同源重组为基础的植物RNAi表达载体构建。以Gateway为代表的同源重组RNAi表达载体构建方法，以其高效、快捷的特点而广泛得到应用。用该方法培育抗病毒品种的研究也有报道如Kamachi等利用黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）的外壳蛋白基因得到了稳定的抗病株系；颜培强等利用TMV的外壳蛋白基因构建RNAi载体并转化到烟草中，转基因植株表现了良好的抗性。但在番茄上，TYLCV和ToCV经常发生复合感染，必须构建抗两种病毒沉默载体才能培育出多种抗性的番茄材料。本专利技术利用Gateway技术，构建TYLCV和ToCV的外壳蛋白基因保守区段的双价RNAi植物表达载体，进一步转化番茄培育抗病毒材料，为番茄的抗病育种提供新资源。
技术实现思路
番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒经常发生复合侵染的现象。因为番茄褪绿病毒无抗源，所以目前对该病的防治只能是防止烟粉虱的传播，但烟粉虱体积小，抗药性强，在番茄生产上，这种方法很难奏效。针对上述问题，专利技术人利用RNAi技术进行了大量的研究工作，通过Gateway技术，构建了TYLCV和ToCV的外壳蛋白基因双价RNAi表达载体，通过遗传转化、抗性鉴定等实验方法获得了抗两种病毒的转基因番茄植株。为实现上述目的，本专利技术公开了一种利用Gateway技术构建的TYLCV和ToCV双价RNAi表达载体，其命名为pRNAi-TOCV-TY。所述RNAi表达载体的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示：RNAi序列：atggagaacagtgctgttgcaaacactggtgataacggtggtggccgcaatcctctggttagaccgttagatgatggcgtagatgacgaggtgcagaacttgggcaggagggacgattcgacatctcttattccggctaatcctaatcgatcttccagttgggctttgttgaacccggatactattaattataacgagttaaggaaattgaaggtacactccactaggggtgatactcttaccttgactcaggaagaggagttcgagaagatactcgaatccttttgcaggcgaataatcggtgagaccccgatgacggataagattttcgctggtttctacatgtctatgtgtcaggccattgtaaaccaagggacctcagttaaagcacccggtaataacagtcttgaaaactactttgaggtagatggtgatgtcgaagcgaccaggcgatataatcatttccacgcccgcctcgaaggttcgccgaaggctgaacttcgacagcccatacagcagccgtgctgctgtccccattgtccaaggcacaaacaagcgacgatcatggacgtacaggcccatgtaccggaagcccagaatatacagaatgtatcgaagccctgatgttcctcgtggatgtgaaggcccatgtaaagtccagtcttatgagcaacgggatgatattaagcatactggtattgttcgttgtgttagtgatgttactcgtggatctggaattactcacagagtgggtaagaggttctgtgttaaatcgatatattttttaggtaaagtctggatggatgaaaatatcaagaagcagaatcacactaatcagg本专利技术进一步公开了pRNAi-TOCV-TY表达载体的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：(1)番茄叶片核酸的提取:采集TYLCV发病的番茄叶片,提取总DNA；采集ToCV发病的番茄叶片,采用大连宝生物公司（TaKaRa）RNA提取试剂盒提取RNA，以随机引物OligodT进行反转录合成cDNA。（2）ToCV和TYLCVCP基因片段的获得分别选择ToCV和TYLCV的CP基因保守序列区域设计合成引物，如SEQIDNO.1-4，引物ToCV-F/R扩增ToCV的CP片段；引物TY-F/R扩增TYLCV的CP片段；（3）ToCV和TYLCVCP两个基因串联片的获得将得到的TYLCVCP和ToCVCP的PCR产物混合，再利用引物ToCV-Ｆ和TY-Ｒ进行PCR扩增，得到TYLCVCP和ToCVCP的串联基因ToCV-TY片段，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，回收获得的串联基因片段合名为TOCV-TY，将TOCV-TY连接转入pMD18-T载体，获得重组质粒P-TOCV-TY；（4）带attB接头串联基因的获得以重组质粒P-ToCV-TY为模板，用attB-TOCV-F和attB-TY-R引物进行PCR，将B序列分别加到串联基因的上游和下游；（5）利用Gateway技术获得入门载体将带有attB接头的PCR产物纯化，回收并测序，利用此PCR产物与pDONRTM221Vector进行BP反应，获得入门载体pDONR221-TOCV-TY，将反应的溶液转化DH5α，37℃培养16h后，利用M13F/R引物进行PCR检测，筛选阳性克隆，将得到的阳性克隆进行测序鉴定；（6）表达载体的获得将获得的入门克隆与表达载体pK7GWIWG2(I)0进行LR反应，获得pK7GWIWG2(I)0-TOCV-TY表达载体，即为RNAi表达载体命名为pRNAi-TOCV-TY，将反应产物转化大肠杆菌DH5α，利用引物p35S和TY-R进行菌落PCR。阳性菌落用引物P35SP和T35SP进行正反向测序来验证联接方向的正确性。从阳性克隆且方向正确的菌落中提取pRNAi-TOCV-TY质粒，转化农杆菌GV3101；本专利技术更进一步公开了TYLCV和ToCV双价RNAi表达载体pRNAi-TOCV-TY在有效防治ToCV和TYLCV的复合侵染番茄方面的应用。所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用Gateway技术构建的TYLCV和ToCV双价RNAi表达载体，其命名为pRNAi‑ TOCV‑TY；所述RNAi表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

【技术特征摘要】
1.一种利用Gateway技术构建的TYLCV和ToCV双价RNAi表达载体，其命名为pRNAi-TOCV-TY；所述RNAi表达载体的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。2.权利要求1所述pRNAi-TOCV-TY表达载体的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：(1)番茄叶片核酸的提取:采集TYLCV发病的番茄叶片,提取总DNA；采集ToCV发病的番茄叶片,采用大连宝生物公司（TaKaRa）RNA提取试剂盒提取RNA，以随机引物OligodT进行反转录合成cDNA；（2）ToCV和TYLCVCP基因片段的获得分别选择ToCV和TYLCV的CP基因保守序列区域设计合成引物,如SEQIDNO.1-4所示，引物ToCV-F/R扩增ToCV的CP片段；引物TY-F/R扩增TYLCV的CP片段；（3）ToCV和TYLCVCP两个基因串联片的获得将得到的TYLCVCP和ToCVCP的PCR产物混合，利用引物ToCV-Ｆ和TY-Ｒ进行PCR扩增，得到TYLCVCP和ToCVCP的串联基因ToCV-TY片段，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，回收获得的串联基因片段合名为TOCV-TY，将TOCV-TY连接转入pMD18-T载体，...

【专利技术属性】
技术研发人员：金凤媚，宋建，薛俊，孙海波，
申请(专利权)人：天津市农业生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：天津,12