一种大黄鱼头肾巨噬细胞系的建立方法技术

本发明专利技术公开了一种大黄鱼头肾巨噬细胞系的建立方法，选取高纯度的海水鱼大黄鱼原代头肾巨噬细胞，28℃条件下在含15％FBS的DMEM/F12中连续培养，利用培养基半数更换的换液方法，培养7d左右巨噬细胞开始增殖并在14d左右长满培养瓶，借助PBS‑EDTA辅助胰酶消化法进行巨噬细胞传代，成功建立了一种巨噬细胞系。本发明专利技术的有益效果是提供了一种简单有效的海水鱼大黄鱼头肾巨噬细胞系的建立方法。

Establishment of a Kidney Macrophage Line from the Head of Pseudosciaena crocea

【技术实现步骤摘要】
一种大黄鱼头肾巨噬细胞系的建立方法
本专利技术属于细胞生物学
，涉及一种大黄鱼头肾巨噬细胞系的建立方法。
技术介绍
海水鱼类养殖为人类提供了大量的优质蛋白源及EPA和DHA等高质量n-3系列长链多不饱和脂肪酸。伴随着海水鱼养殖业的蓬勃发展，鱼体病害频发的问题日益显著，严重危害产业的健康可持续发展。近年来，水生生物免疫研究向更加精细化的细胞研究及更加深入化的分子机制研究延伸，丰富的基础研究成果为调控鱼体健康提供了有价值的参考，鱼类的原代细胞培养技术在其中发挥了重要作用。然而，原代细胞培养存在操作复杂、耗费较大和实验动物来源不稳定等缺点，尤其实验动物来源的不稳定性往往导致实验结果重复性较差，其受到水温、季节、鱼体生长阶段和鱼体健康状况等诸多因素的影响。因此，有必要建立操作简单、成本较低且研究结果稳定的鱼类免疫细胞系。头肾作为鱼类特有的一种免疫组织，在鱼体抵御病原入侵维持机体健康中发挥着至关重要的作用，巨噬细胞是头肾组织发挥免疫功能的关键细胞种类。目前，虽然在金鱼、罗非鱼和鲤鱼等淡水鱼类中建有巨噬细胞系，但淡水鱼和海水鱼所处的生活环境，包括盐度和致病菌类群显著不同，因此二者在免疫和进化方面存在诸多差异，导致淡水鱼细胞系的研究结果往往并不适用于海水鱼，且淡水鱼细胞系的构建方法也并不适用于海水鱼。所以，一种简单有效的海水鱼类巨噬细胞系建立方法非常需要。大黄鱼，我国传统“四大海产”之首，是我国特有的海水养殖经济鱼类。根据《2017年中国渔业年鉴》，2017年，大黄鱼年养殖产量为17.76万吨，是我国海水鱼类养殖规模最大的品种。目前，大黄鱼的基因组、基础营养数据库和基础免疫研究等已经齐备，因此成为了海水鱼类科学研究和应用研究的重要对象。截至目前，在大黄鱼上已经成功建立了肝、脾、肌、脑、鳍、心和肾等组织的细胞系。然而，头肾巨噬细胞作为一种重要且特有的鱼类免疫细胞，并没有在海水鱼大黄鱼上成功构建，原因可能是海水鱼与淡水鱼的差异导致细胞系的构建方法并不通用。因此，寻找一种简单有效的大黄鱼头肾巨噬细胞系建立方法非常有必要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种大黄鱼头肾巨噬细胞系的建立方法，本专利技术的有益效果是提供了一种简单有效的海水鱼大黄鱼头肾巨噬细胞系的建立方法，成功建立并鉴定了一种大黄鱼头肾巨噬细胞系，其对细菌致病组分内毒素刺激具有灵敏有效的响应。此头肾巨噬细胞系的建立为以大黄鱼为代表的海水鱼类精细化及深入化的免疫研究提供了便利、低成本和稳定的实验材料。本专利技术所采用的技术方案是按照以下步骤进行：选择400-500g左右的健康大黄鱼，丁香酚麻醉后酒精棉擦拭鱼体消毒。无菌解剖取头肾组织，去除脂肪组织和结缔组织等，注射器推头碾磨头肾组织通过100μm滤网制成细胞悬液，利用Percoll密度梯度离心方法分离纯化巨噬细胞。巨噬细胞贴壁12h后，利用瑞姬氏染色实验检测巨噬细胞的纯度。选择高纯度的头肾巨噬细胞，28℃条件下在含15％FBS的DMEM/F12完全培养基中进行连续培养。2d更换一次培养基，采用半数更换的方法进行培养基更换，即弃去一半原有旧培养基，并用新鲜培养基补足。从贴壁培养第7d开始，巨噬细胞开始增殖，继续进行2d换液一次的连续培养，在14d时，梭形细胞长满培养瓶。细胞传代时首先利用冰冷的含10mMEDTA的PBS缓冲液反复冲洗细胞三次，随后加入冰冷的含1mMEDTA的0.25％胰酶覆盖整个细胞单层，水平晃动20s后吸弃胰酶。28℃条件下消化5min左右直至细胞脱离培养瓶瓶壁。之后，加入与原培养基相同体积的完全培养基，混匀后将细胞平均分到两个新培养瓶中继续进行培养。细胞传代时间根据细胞增殖长满培养瓶时间确定。在传代前10代，平均5d传代一次，之后2d传代一次，且传代时无需再保留一半原培养基，直到传代达到100代。进一步，头肾巨噬细胞系来源于经过瑞姬氏染色实验检测过的高纯度大黄鱼原代头肾巨噬细胞，这是巨噬细胞系建立的基础；进一步，头肾巨噬细胞系培养条件为28℃，培养基为含15％FBS的DMEM/F12完全培养基，这有别与原代巨噬细胞22℃的最适培养温度条件及5％FBS的血清浓度，相对较高的温度和血清浓度有助于巨噬细胞的增殖；进一步，培养基更换方法为半数更换的方法，即保留一半旧培养基并利用一半新鲜培养基补齐。传代前10代时细胞增殖能力较弱，旧培养基中含有生长因子等细胞因子，因此旧培养基的半数保留对巨噬细胞的增殖有促进作用；进一步，巨噬细胞系的传代方法为用冰冷的含10mMEDTA的PBS缓冲液反复冲洗，再用含1mMEDTA的0.25％胰酶在28℃条件下消化至细胞脱壁。由于巨噬细胞贴壁牢固，仅用胰酶达不到良好的脱壁效果，需先用冰冷的PBS-EDTA冲洗，之后在细胞生长的28℃条件下消化，而不是对细胞损害较大的较高温度37℃；进一步，巨噬细胞系在传代达到10代后，细胞的增殖效率显著提升，10代之后按照2d一代的传代频率进行细胞传代，直到100代成为细胞系；进一步，利用瑞姬氏染色实验、酵母和荧光微球吞噬实验以及分子标记检测实验鉴定所建立细胞系为巨噬细胞系；进一步，利用细菌致病组分脂多糖孵育细胞，检测免疫炎性相关基因表达，鉴定所建立头肾巨噬细胞系的免疫响应情况。附图说明图1大黄鱼头肾巨噬细胞系显微镜观察；图2大黄鱼头肾巨噬细胞系扫描电镜观察；图3大黄鱼头肾巨噬细胞系透射电镜观察；图4巨噬细胞系瑞姬氏染色观察；图5显微镜观察巨噬细胞系吞噬酵母和荧光微球，左为酵母，右为微球；图6透射电镜观察巨噬细胞系吞噬荧光微球，左无微球，右有微球；图7巨噬细胞标记分子检测；图8检测免疫炎性相关IL-1β基因表达，反映所建立巨噬细胞系对细菌致病组分脂多糖刺激的响应；图9检测免疫炎性相关TNFα基因表达，反映所建立巨噬细胞系对细菌致病组分脂多糖刺激的响应。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行详细说明。1.1大黄鱼头肾巨噬细胞的原代培养选择400-500g左右的健康大黄鱼，丁香酚麻醉后酒精棉擦拭鱼体消毒。无菌解剖取头肾组织，去除脂肪组织和结缔组织等，注射器推头碾磨头肾组织通过100μm滤网制成细胞悬液，利用Percoll密度梯度离心方法分离纯化巨噬细胞。巨噬细胞贴壁12h后，利用瑞姬氏染色实验检测巨噬细胞的纯度，要求巨噬细胞纯度在99％以上。头肾巨噬细胞纯度的筛选至关重要，这为巨噬细胞系的建立提供了保障，否则细胞系难以建立或建成非巨噬细胞系。1.2原代巨噬细胞的连续培养选择高纯度的头肾巨噬细胞，28℃条件下在含15％FBS的DMEM/F12完全培养基中进行连续培养。2d更换一次培养基，采用半数更换的方法进行培养基更换，即弃去一半原有旧培养基，并用新鲜培养基补足。原培养基的半数保留对于巨噬细胞的增殖至关重要，其中含有细胞增殖所需的生长因子等细胞因子，有利于巨噬细胞的增殖。1.3巨噬细胞的传代与细胞系的建立从贴壁培养7d开始，巨噬细胞开始增殖，继续进行2d换液一次的连续培养，在14d时，梭形细胞长满培养瓶。细胞传代时首先利用冰冷的含10mMEDTA的PBS缓冲液反复冲洗细胞三次，随后加入冰冷的含1mMEDTA的0.25％胰酶覆盖整个细胞单层，水平晃动20s后吸弃胰酶。28℃条件下消化5min左右直至细胞脱离培养瓶瓶壁。细胞脱离瓶壁后，加入本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大黄鱼头肾巨噬细胞系的建立方法，其特征在于按照以下步骤进行：选择400‑500g左右的健康大黄鱼，丁香酚麻醉后酒精棉擦拭鱼体消毒，无菌解剖取头肾组织，去除脂肪组织和结缔组织，注射器推头碾磨头肾组织通过100μm滤网制成细胞悬液，分离纯化巨噬细胞，巨噬细胞贴壁12h后，利用瑞姬氏染色实验检测巨噬细胞的纯度，选择高纯度的头肾巨噬细胞，28℃条件下在含15％FBS的DMEM/F12完全培养基中进行连续培养，2d更换一次培养基，采用半数更换的方法进行培养基更换，从贴壁培养第7d开始，巨噬细胞开始增殖，继续进行2d换液一次的连续培养，在14d时，梭形细胞长满培养瓶，细胞传代时首先利用冰冷的含10mM EDTA的PBS缓冲液反复冲洗细胞三次，随后加入冰冷的含1mM EDTA的0.25％胰酶覆盖整个细胞单层，水平晃动20s后吸弃胰酶，28℃条件下消化5min左右直至细胞脱离培养瓶瓶壁，之后，加入与原培养基相同体积的完全培养基，混匀后将细胞平均分到两个新培养瓶中继续进行培养，细胞传代时间根据细胞增殖长满培养瓶时间确定，在传代前10代，平均5d传代一次，之后2d传代一次，且传代时无需再保留一半原培养基，直到传代达到100代。...

【技术特征摘要】
1.一种大黄鱼头肾巨噬细胞系的建立方法，其特征在于按照以下步骤进行：选择400-500g左右的健康大黄鱼，丁香酚麻醉后酒精棉擦拭鱼体消毒，无菌解剖取头肾组织，去除脂肪组织和结缔组织，注射器推头碾磨头肾组织通过100μm滤网制成细胞悬液，分离纯化巨噬细胞，巨噬细胞贴壁12h后，利用瑞姬氏染色实验检测巨噬细胞的纯度，选择高纯度的头肾巨噬细胞，28℃条件下在含15％FBS的DMEM/F12完全培养基中进行连续培养，2d更换一次培养基，采用半数更换的方法进行培养基更换，从贴壁培养第7d开始，巨噬细胞开始增殖，继续进行2d换液一次的连续培养，在14d时，梭形细胞长满培养瓶，细胞传代时首先利用冰冷的含10mMEDTA的PBS缓冲液反复冲洗细胞三次，随后加入冰冷的含1mMEDTA的0.25％胰酶覆盖整个细胞单层，水平晃动20s后吸弃胰酶，28℃条件下消化5min左右直至细胞脱离培养瓶瓶壁，之后，加入与原培养基相同体积的完全培养基，混匀后将细胞平均分到两个新培养瓶中继续进行培养，细胞传代时间根据细胞增殖长满培养瓶时间确定，在传代前10代，平均5d传代一次，之后2d传代一次，且传代时无需再保留一半原培养基，直到传代达到100代。2.按照权利要求1所述一种大黄鱼头肾巨噬细胞系的建立方法，其特征在于：所述头肾巨噬细胞系...

【专利技术属性】
技术研发人员：艾庆辉，崔坤，李庆飞，徐丹，麦康森，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37