一种改造枯草芽孢杆菌FMMs的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种改造枯草芽孢杆菌FMMs的方法及其应用，属于遗传工程技术领域。本发明专利技术通过强化固醇类似物前体合成酶——角鲨烯合酶和脚手架蛋白显著增加质膜上FMMs占比。本发明专利技术构建的重组枯草芽孢杆菌BSGFMM1‑AY与对照菌株BSGN6‑AY相比，可以更多地将N‑乙酰氨基葡萄糖合成所需的途径酶固定在FMMs中，形成底物通道，显著提高酶的催化效率。在复合培养基摇瓶发酵过程中，对照菌株BSGN6‑AY的GlcNAc滴定量仅为2.84g/L，而BSGFMM1‑AY的GlcNAc滴定量增加至8.86g/L。本发明专利技术的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，普适性高，便于使用，具有很好的应用前景。

A Method of Modifying Bacillus subtilis FMMs and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种改造枯草芽孢杆菌FMMs的方法及其应用
本专利技术涉及一种改造枯草芽孢杆菌FMMs的方法及其应用，属于遗传工程

技术介绍
膜筏是细胞质膜上富含胆固醇等物质的一类结构致密性微区，富含长链饱和脂肪链，流动性较小，大小约为70nm左右。膜筏除了具有上述组分外，还富含一些脚手架蛋白，这些蛋白通常含有某些特殊的结构域，比如SPFH(Stomatin-Prohibitin-Flotillin-HflC/K)结构域，不仅在功能上依赖膜筏，而且还影响着膜筏的形成和稳定。膜筏可以为蛋白聚集提供平台，便于蛋白间的相互作用，且膜筏微环境有利于蛋白正确折叠和有效变构，此外，膜筏还与应答细胞对生物和非生物刺激的响应。细菌中的“膜筏”被称为功能膜微域(FunctionalMembraneMicrodomains,FMMs)，细菌中缺乏胆固醇的存在，FMMs中存在的并不是胆固醇而是固醇类似物，该物质的合成与角鲨烯密切相关。微生物在自然进化过程中，主要通过形成多酶复合体，生成底物通道，提高代谢途径连续多步反应的催化效率。近年来，研究者提出通过构建空间支架结构，将所需要组装的酶锚定在空间支架上以提高催化效率。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为GRAS(GenerallyRegardedasSafe)安全级别。专利技术人前期以枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)为例，发现将GlcNAc合成途径中的酶固定于细胞内源性支架—FMMs上时，GlcNAc的产量显著提高。此外，发酵后期往往出现较严重的细胞裂解现象，最终抑制产物的高效合成。因此如何改造FMMs以便更好地进行酶固定，以及减弱发酵后期细胞的裂解是目前代谢工程领域亟待解决的问题。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术通过强化固醇类似物的合成途径及过表达脚手架蛋白的特异性结构域(SPFH结构域)，并结合质膜有序度分析对FMMs进行改建，最终显著增加质膜上FMMs的占比。本专利技术进一步将酶锚定在FMMs上，与未进行FMMs改建的对照组菌株相比，乙酰氨基葡萄糖发酵产量大大提高。本专利技术的第一个目的是提供一种改造重组枯草芽孢杆菌FMMs的方法，所述重组枯草芽孢杆菌整合表达角鲨烯合酶Yisp，游离表达SPFH结构域。在本专利技术的一种实施方式中，所述角鲨烯合酶Yisp的编码基因的核苷酸序列如NCBI-GeneID:936353所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述角鲨烯合酶Yisp编码基因yisp使用强组成型启动子P43表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述SPFH结构域的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的第二个目的是提供另一株重组菌株应用于乙酰氨基葡萄糖的生产中，将上述整合表达角鲨烯合酶Yisp，游离表达SPFH结构域的重组菌株中进一步融合表达SPFH结构域与乙酰氨基葡萄糖脱磷酸酶YqaB，融合表达SPFH结构域与氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶GNA1的编码基因的核苷酸序列如NCBI-GeneID:179437所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述乙酰氨基葡萄糖脱磷酸酶YqaB的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌BSGN6为出发菌株。枯草芽孢杆菌BSGN6敲除了nagP、gamP、gamA、nagA、nagB、ldh、pta等基因，具体参见文献(LiuY.,Zhu,Y.,Li,J.,Shin,H.D.,Chen,R.R.,Du,G.,Liu,L.&Chen,J.ModularpathwayengineeringofBacillussubtilisforimprovedN-acetylglucosamineproduction.Metabolicengineering2014,23:42-52.)。在本专利技术的一种实施方式中，所述GNA1与SPFH结构域之间连接的linker的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述SPFH-GNA1融合表达片段整合至pP43NMK中并使用强组成型启动子P43表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述YqaB与SPFH结构域之间连接的linker的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述SPFH-YqaB融合表达片段整合至基因组中并使用强组成型启动子P43表达。本专利技术的第三个目的是提供一种基于枯草芽孢杆菌FMMs改建的空间支架-多酶复合体系统的构建方法，以枯草芽孢杆菌BSGN6为宿主，整合表达角鲨烯合酶Yisp，游离表达脚手架蛋白特异结构域SPFH，融合表达SPFH结构域与乙酰氨基葡萄糖脱磷酸酶YqaB，融合表达SPFH结构域与氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶。通过增加FMMs各组分的合成或表达以提高FMMs在质膜上的占比，之后以改建后的FMMs作为空间支架，通过SPFH结构域将需要表达的途径酶固定于FMMs上，形成空间支架-多酶复合体系统。本专利技术的第四个目的是提供所述重组枯草芽孢杆菌在发酵生产乙酰氨基葡萄糖中的应用，是以上述重组枯草芽孢杆菌为生产菌株发酵生产乙酰氨基葡萄糖。在本专利技术的一种实施方式中，将重组枯草芽孢杆菌在36-38℃下在种子培养基中活化，活化后的种子以2～5％的接种量转入发酵培养基中，在36-38℃下发酵培养。在本专利技术的一种实施方式中，以其重量为基准，种子培养基包括以下成分：5～15g/L蛋白胨、5～10g/L酵母粉和5～15g/L氯化钠。在本专利技术的一种实施方式中，以其重量为基准，种子培养基包括以下成分：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L氯化钠。在本专利技术的一种实施方式中，以其重量为基准，发酵培养基包括以下成分：40-60g/L葡萄糖、10～15g/L酵母粉、5～8g/L蛋白胨、5～8g/L硫酸铵、2～3g/L磷酸二氢钾、10～15g/L磷酸氢二钾、4～6g/L碳酸钙和8～12ml/L微量元素溶液。在本专利技术的一种实施方式中，以其重量为基准，微量元素溶液包括以下成分：0.8～1.2g/L硫酸锰、0.1～0.3g/L钼酸钠、0.2～0.6g/L氯化钴、0.1～0.3g/L氯化铝、0.1～0.3g/L氯化铜、0.1～0.3g/L硫酸锌、0.04～0.06g/L硼酸和3～8mol/L盐酸。在本专利技术的一种实施方式中，活化后的种子以2～5％的接种量转入发酵培养基中进行培养。本专利技术的第五个目的是提供上述重组菌株在制药领域的应用。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种基于FMMs改建提高重组枯草芽孢杆菌氨糖产量的方法，提高FMMs在质膜上的占比，并在此基础上借助SPFH结构域设计和构建多酶复合体，搭建人工底物通道，高效合成GlcNAc。在使用复合培养基摇瓶发酵过程中，对照菌株BSGN6-AY的乙酰氨基葡萄糖的产量仅为2.84g/L，而BSGFMM1-AY的乙酰氨基葡萄糖产量增加至8.86g/L，是对照菌株BSGN6-AY的3.12倍。本专利技术的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。附图说明图1为不同菌株中质膜有序度分析；A.DI-4-ANEP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌过表达角鲨烯合酶Yisp和过表达脚手架蛋白特结构域异SPFH。

【技术特征摘要】
1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌过表达角鲨烯合酶Yisp和过表达脚手架蛋白特结构域异SPFH。2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述角鲨烯合酶Yisp的编码基因的核苷酸序列如NCBI-GeneID:936353所示。3.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述SPFH结构域的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。4.根据权利要求1-3任一所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌融合表达SPFH结构域与乙酰氨基葡萄糖脱磷酸酶YqaB，融合表达SPFH结构域与氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶GNA1。5.根据权利要求4所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶GNA1的编码基因的核苷酸序列如NCBI-GeneID:179437所示。6.根据权利要求4所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，吕雪芹，张成，金柯，李梦莹，李江华，堵国成，陈坚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32