间充质干细胞外泌组组合制剂及制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物医药领域，本发明专利技术公开了一种间充质干细胞外泌组组合制剂及制备方法和应用。其中间充质干细胞外泌组组合制剂按重量份数计，包括：人间充质干细胞外泌组培养介质：80‑90份，中小分子量透明质酸钠：2‑5份，黄芪提取物：3‑5份、蕲艾提取物：1‑5份，所述外泌组培养介质来源于人的脐带或脂肪；所述黄芪提取物的有效组分为：黄芪苷I、黄芪苷II、黄芪苷IV、黄芪多糖I、黄芪多糖II和黄芪多糖III；所述蕲艾提取物的有效组分为：桉油精、崖柏酮、樟脑、冰片、4‑萜烯醇、1‑石竹烯、4‑甲基苄醇、黄酮、鞣酸和绿原酸。本发明专利技术的外用制剂能有效的利用干细胞外泌组生物活性成分，具有解决皮肤炎症、修复与抗衰老功效。

Composite preparation of exocrine group of mesenchymal stem cells and its preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
间充质干细胞外泌组组合制剂及制备方法和应用
本专利技术涉及生物医药领域，具体地说是涉及一种间充质干细胞外泌组组合制剂及制备方法和应用。
技术介绍
本专利技术对于
技术介绍
的描述属于与本专利技术相关的相关技术，仅仅是用于说明和便于理解本专利技术的
技术实现思路
，不应理解为申请人明确认为或推定申请人认为是本专利技术在首次提出申请的申请日的现有技术。间充质干细胞是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，可取自骨髓、脐带、脐血、脂肪等组织来源丰富，具有免疫原性低等优点，在再生医学领域具有广泛应用。分泌组是指细胞通过旁分泌和自分泌释放到细胞外空间的复杂因子混合物，包括多种细胞因子、生长因子、外泌体囊泡等，统称分泌组，具有通过控制炎症以及诱导选择性蛋白质激活和转录来改变微环境，以及传递局部信息的作用。大量研究证明间充质干细胞MSCs通过旁分泌和自分泌释放多种细胞因子和生长因子(分泌组)，能够抑制炎症，加速皮肤细胞迁移和增殖，抑制纤维化和凋亡，控制伤口瘢痕形成，改善血管生成，参与组织修复再生，甚至改善皮肤衰老的迹象。但间充质干细胞的分泌组具有成分、含量、活性呈现动态变化的特点，如何将其有效分离、保存活性、提升效果已成为该领域需要解决的问题。皮肤由表皮、真皮、皮下组织组成，包括胶原纤维、弹力纤维、基质、血管、神经、皮脂腺、汗腺、毛囊等复杂成分。紫外线损伤、年龄老化和各种皮肤炎症是影响皮肤健康的三大主要问题，细胞外基质胶原蛋白和弹性蛋白储藏含量是皮肤外观年轻化的重要指标，是预防皮肤脱水以及坚固和弹性保存的关键。分泌组虽然可以整体调整皮肤的微环境和细胞功能，但其如何渗透进入皮肤屏障并发挥作用，皮肤的状态、湿度、温度等微环境因素非常重要。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的是提供一种充质干细胞外泌组组合制剂及制备方法和应用，通过该方法制备的皮肤护理制剂能有效的利用干细胞外泌组生物活性成分，具有解决皮肤炎症、修复与抗衰老功效。本专利技术第一方面的实施例提供了一种间充质干细胞外泌组组合制剂，按重量份数计，包括：人间充质干细胞外泌组培养介质：80-90份，中小分子量透明质酸钠：2-5份，黄芪提取物：3-5份、蕲艾提取物：1-5份，所述外泌组培养介质来源于人的脐带或脂肪；所述黄芪提取物的有效组分为：黄芪苷I、黄芪苷II、黄芪苷IV、黄芪多糖I、黄芪多糖II和黄芪多糖III；所述蕲艾提取物的有效组分为：桉油精、崖柏酮、樟脑、冰片、4-萜烯醇、1-石竹烯、4-甲基苄醇、黄酮、鞣酸和绿原酸。进一步的，所述的黄芪提取物是采用如下方法制备的：取黄芪加水煎煮煎液，滤过，滤液浓缩，加乙醇静置，取上清液回收乙醇，浓缩，干燥，粉碎成细粉，即得所述的黄芪提取物。进一步的，所述蕲艾提取物是采用如下方法制备的：取艾叶，加入所述艾叶重量10-20％的醋，于170-270℃下炒20-30min后，干燥粉碎，所得粉碎料中加入质量浓度30-50％的乙醇溶液，所述粉碎料与乙醇溶液的料液比为1g∶10-30mL，回流条件下萃取1-5h，过滤，滤液浓缩，得所述蕲艾提取物。进一步的，按重量份数计，包括：人间充质干细胞外泌组培养介质：90份，中小分子量透明质酸钠：0.5份，黄芪提取物：5份、蕲艾提取物：4.5份，所述人间充质干细胞来源于人的脐带或脂肪。进一步的，所述的中小分子量透明质酸钠分子量为200kda-400kda。进一步的，所述人间充质干细胞外泌组培养介质是通过以下方法制备的：(1)间充质干细胞分离培养：在4℃条件下将脐带装于50mL离心管，经第一PBS保护液清洗3遍，所述的第一PBS保护液中庆大霉素终浓度为25ug/mL，再用第二PBS保护液清洗2遍，去除两端各0.5cm长的脐带，将其余脐带剪成2cm长小段，装于50mL离心管中，添加所述的第二PBS保护液，清洗至上清无血色；所述的第一PBSPBS保护液包括如下组分：NaCl：8.0mg/mL，KCl：200ug/mL，Na2HPO4·H2O：1.56mg/mL，KH2PO4：200ug/mL，庆大霉素：25ug/mL，PH值为7.2；所述的第二PBSPBS保护液包括如下组分：NaCl：8.0mg/mL，KCl：200ug/mL，Na2HPO4·H2O：1.56mg/mL，KH2PO4：200ug/mL，PH值为7.2；沿静脉内腔纵向剪开清洗后的脐带，剥离静脉内膜，继而将覆盖动脉的华通氏胶表面略微撕开，而后抽出两根动脉，将华通氏胶撕下，去除脐带外皮；用手术剪或手术刀将华通氏胶剪切成边长3-5mm左右的小块，并加入100mm皿中，超净台内静置15分钟，组织块贴壁后，添加完全培养基，使得皿中含有10mL培养基，轻轻摇晃均匀，盖上盖子放入培养箱；每隔3天换液，7-14天陆续有间充质干细胞爬出；(2)收集间充质干细胞：PBS漂洗爬出间充质干细胞1遍，采用消化酶消化细胞1-2分钟，加入4倍消化酶体积培养基终止消化，800g离心5分钟，吸弃上清，用培养基重悬细胞，收集细胞种到细胞瓶中；细胞计数，细胞种植密度：8000个/平方厘米；细胞传代培养，3天传代一次；(3)外泌组培养介质收集：选取细胞状态较好的2-5代间充质干细胞培养48h后，富集培养上清于50ml离心管中，1000g离心10分钟，去除细胞碎片及杂蛋白，弃掉沉淀，将上清液置于4度冰箱备用；所述的消化酶包括胶原酶、透明质酸酶和胰酶。进一步的，所述的完全培养基包括如下组分：无水氯化钙116.6mg/L，L-亮氨酸59.05mg/L，亚油酸0.042mg/L，五水硫酸铜0.0013mg/L，L-赖氨酸盐酸盐91.25mg/L，硫辛酸0.105mg/L，九水硝酸铁0.05mg/L，L-蛋氨酸17.24mg/L，酚红8.1mg/L，七水硫酸亚铁0.417mg/L，L-苯丙氨酸35.48mg/L，1，4-丁二胺二盐酸盐0.081mg/L，氯化钾311.8mg/L，L-丝氨酸26.25mg/L，丙酮酸钠55mg/L，氯化镁28.64mg/L，L-苏氨酸53.45mg/L，维生素H0.0035mg/L，无水硫酸镁48.84mg/L，L-丙氨酸4.45mg/L，D-泛酸钙2.24mg/L，氯化钠6999.5mg/L，L-天门冬酰胺7.5mg/L，氯化胆碱8.98mg/L，无水磷酸二氢钠54.35mg/L，L-天门冬氨酸6.65mg/L，叶酸2.65mg/L，磷酸氢二钠71.02mg/L，L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg/L，i-肌醇12.6mg/L，七水硫酸锌0.432mg/L，L-谷氨酸7.35mg/L，烟酰胺2.02mg/L，L-精氨酸盐酸盐147.5mg/L，L-脯氨酸17.25mg/L，盐酸吡哆醛2mg/L，L-胱氨酸盐酸盐31.29mg/L，L-色氨酸9.02mg/L，盐酸吡哆醇0.031mg/L，L-谷氨酰胺365mg/L，L-酪氨酸38.4mg/L，核黄素0.219mg/L，甘氨酸18.75mg/L，L-缬氨酸52.85mg/L，盐酸硫胺2.17mg/L，L-组氨酸盐酸盐31.48mg/L，D-葡萄糖3151mg/L，胸苷0.365mg/L，L-异亮氨酸54.47mg/L，次黄嘌呤2mg/L，维生素B120.68mg/L。本专利技术第二方面的实施例提供了一种间充质干细胞外泌组组合制剂的制备方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种间充质干细胞外泌组组合制剂，其特征在于，按重量份数计，包括：人间充质干细胞外泌组培养介质：80‑90份，中小分子量透明质酸钠：2‑5份，黄芪提取物：3‑5份、蕲艾提取物：1‑5份，所述外泌组培养介质来源于人的脐带或脂肪；所述黄芪提取物的有效组分为：黄芪苷I、黄芪苷II、黄芪苷IV、黄芪多糖I、黄芪多糖II和黄芪多糖III；所述蕲艾提取物的有效组分为：桉油精、崖柏酮、樟脑、冰片、4‑萜烯醇、1‑石竹烯、4‑甲基苄醇、黄酮、鞣酸和绿原酸。

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞外泌组组合制剂，其特征在于，按重量份数计，包括：人间充质干细胞外泌组培养介质：80-90份，中小分子量透明质酸钠：2-5份，黄芪提取物：3-5份、蕲艾提取物：1-5份，所述外泌组培养介质来源于人的脐带或脂肪；所述黄芪提取物的有效组分为：黄芪苷I、黄芪苷II、黄芪苷IV、黄芪多糖I、黄芪多糖II和黄芪多糖III；所述蕲艾提取物的有效组分为：桉油精、崖柏酮、樟脑、冰片、4-萜烯醇、1-石竹烯、4-甲基苄醇、黄酮、鞣酸和绿原酸。2.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌组组合制剂，其特征在于，所述的黄芪提取物是采用如下方法制备的：取黄芪加水煎煮煎液，滤过，滤液浓缩，加乙醇静置，取上清液回收乙醇，浓缩，干燥，粉碎成细粉，即得所述的黄芪提取物。3.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌组组合制剂，其特征在于，所述蕲艾提取物是采用如下方法制备的：取艾叶，加入所述艾叶重量10-20％的醋，于170-270℃下炒20-30min后，干燥粉碎，所得粉碎料中加入质量浓度30-50％的乙醇溶液，所述粉碎料与乙醇溶液的料液比为1g∶10-30mL，回流条件下萃取1-5h，过滤，滤液浓缩，得所述蕲艾提取物。4.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌组组合制剂，其特征在于，按重量份数计，包括：人间充质干细胞外泌组培养介质：90份，中小分子量透明质酸钠：0.5份，黄芪提取物：5份、蕲艾提取物：4.5份，所述人间充质干细胞来源于人的脐带或脂肪。5.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌组组合制剂，其特征在于，所述的中小分子量透明质酸钠分子量为200kda-400kda。6.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌组组合制剂，其特征在于，所述人间充质干细胞外泌组培养介质是通过以下方法制备的：(1)间充质干细胞分离培养：在4℃条件下将脐带装于50mL离心管，经第一PBS保护液清洗3遍，所述的第一PBS保护液中庆大霉素终浓度为25ug/mL，再用第二PBS保护液清洗2遍，去除两端各0.5em长的脐带，将其余脐带剪成2cm长小段，装于50mL离心管中，添加所述的第二PBS保护液，清洗至上清无血色；所述的第一PBSPBS保护液包括如下组分：NaCl：8.0mg/mL，KCl：200ug/mL，Na2HPO4·H2O：1.56mg/mL，KH2PO4：200ug/mL，庆大霉素：25ug/mL，PH值为7.2；所述的第二PBSPBS保护液包括如下组分：NaCl：8.0mg/mL，KCl：200ug/mL，Na2HPO4·H2O：1.56mg/mL，KH2PO4：200ug/mL，PH值为7.2；沿静脉内腔纵向剪开清洗后的脐带，剥离静脉内膜，继而将覆盖动脉的华通氏胶表面略微撕开，而后抽出两根动脉，将华通氏胶撕下，去除脐带外皮；用手术剪或手术刀将华通氏胶剪切成边长3-5mm左右的小块，并加入100mm皿中，超净台内静置15分钟，组织块贴壁后，添加完全培养基，使得皿中含有10mL培养基，轻轻摇晃均匀，盖上盖子放入培养箱；每隔3天换液，7-14天陆续有间充质干细胞爬出；(2)收集间充质干细胞：PBS漂洗爬出间充质干细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴曙霞，李玉霞，谢创丰，
申请(专利权)人：深圳市艾一生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44