一种快速检测蛋白质异构体的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测蛋白质异构体的方法，以待检测的蛋白质为原料，利用分子排阻色谱法对待检测的蛋白质进行分离，然后利用在线层析‑质谱对蛋白质异构体进行质谱鉴定。本发明专利技术所述的方法方便简单，不需要诸如化学或者酶解等前处理，只需一次离子交换层析就能鉴定蛋白质中的异构体。因此，这个技术能实现蛋白质的快速分离鉴定，在生物制药领域、医学和化学等许多领域中具有很高的实用价值。

A Rapid Method for Detecting Protein Isomers

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测蛋白质异构体的方法
本专利技术属于蛋白质分离纯化
，尤其涉及一种快速检测蛋白质异构体的方法。
技术介绍
在自然界中，蛋白质的产生是通过精确遗传调控的，但绝大多数蛋白质表现出显著的结构非均一性，这通常是翻译后修饰(Post-translationalmodifications，PTMs)导致的。由于许多PTMs会对体内蛋白质行为及其物理和化学性质产生较大的影响，因此在生物学、医学和化学等许多领域中，蛋白质异构体的检测和表征是一个经常遇到的难题。在给定的蛋白质样本中对所有PTMs进行详尽的定位和表征通常是一项庞大繁重的任务，需要大量资源和时间投入。然而，在许多应用中，特别是在生物
，对于发现PTMs并不是必需的，其重点在于检测上，但是，即使定量分析PTMs也是在特定系统中进行的。例如，对生物制药产品的稳定性研究需要监测与蛋白质结构中已知相关的非酶类PTMs水平，检测这些修饰以及酶促PTMs，对于评估生产过程的变化是至关重要的。单独的质谱技术和毛细管电泳技术鉴定了蛋白质异构体。然而，这些方法都具有一定的局限性。首先，它们不能区分同分异构体，如具有不同磷酸化位点、相同分子质量的磷酸化蛋白质异构体。其次，同时检测大量蛋白异构体不可避免地使相关检测分析复杂化。最后，分析糖基化和磷酸化修饰的蛋白质需要对其进行酶解处理，这会降低蛋白质的完整性。此外，这也会增加其分析时间，同时还会导致一些低丰度异构体的丢失和一些人工误差的增加，比如有些不是在蛋白修饰过程中出现的非酶PTMs会出现在分析过程中。
技术实现思路
为解决现有技术中的不足，本专利技术提供了一种快速检测蛋白质异构体的方法，包含如下步骤：1、蛋白质的纯化：先用醋酸铵溶液平衡分子排阻层析柱，然后将待检测蛋白质溶解于所述醋酸铵溶液中，用0.22μm过滤器进行过滤，再进样于高效液相色谱中，收集各洗脱峰的蛋白质溶液备用；2、蛋白质异构体的质谱鉴定：采用十一氟己酸对傅里叶变换离子回旋共振质谱仪进行校正，然后将高效液相色谱仪与质谱仪连接，用所述醋酸铵溶液平衡离子交换层析柱，将经纯化后的蛋白质溶液进样于HPLC，最后利用DataAnalysis软件分析质谱数据，检测蛋白质异构体。进一步地，所述醋酸铵溶液为溶质浓度为50mmol/L的水溶液。进一步地，所述步骤1中，所述高效液相色谱设置参数为：检测波长280nm，流速0.75mL/min，时间20min。进一步地，所述步骤2中，高效液相色谱参数为：进样量为1.0mg/mL，流速为50μL/min，采集时间为35min。因此，通过上述技术方案可知，本专利技术的有益效果在于：本专利技术所述的方法方便简单，不需要诸如化学或者酶解等前处理，只需一次离子交换层析就能鉴定蛋白质中的异构体。因此，这个技术能实现蛋白质的快速分离鉴定，在生物制药领域、医学和化学等许多领域中具有很高的实用价值。附图说明图1为α-乳白蛋白的SEC图；图2为纯化后α-乳白蛋白的IXC图；图3为α-乳白蛋白中峰1的质谱图；图4为α-乳白蛋白中锋2的质谱图；图5为β-乳球蛋白的SEC图；图6为β-乳球蛋白中峰1(+8)的质谱图；图7为β-乳球蛋白中锋2(+8)的质谱图。具体实施方式下面结合实施例进行详细的说明：实施例1本实施例公开了一种快速检测蛋白质异构体的方法，以α-乳白蛋白为例，具体步骤为：1、α-乳白蛋白的纯化：用50mM的醋酸铵溶液平衡分子排阻层析(sizeexclusionchromatography，SEC)柱(TSKgelG3000SWXL，Tosoh，Japan)，然后将α-乳白蛋白溶解于50mM的醋酸铵溶液中，用0.22μm过滤器进行过滤再进样于高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography，HPLC)中。设置参数为：检测波长280nm，流速0.75mL/min，时间20min。最后收集各洗脱峰的蛋白质溶液备用。2、α-乳白蛋白异构体的质谱鉴定：采用十一氟己酸对傅里叶变换离子回旋共振质谱仪((Fouriertransformioncyclotronresonance-MassSpectrometry,FTICR-MS)进行校正，然后将HPLC与质谱仪连接，用50mM的醋酸铵溶液(pH7.0)平衡离子交换层析(ionexchangechromatography，IXC)柱(ProPacSAX-10，ThermoFisherScientific，USA)，将经SEC纯化后的α-乳白蛋白溶液进样于HPLC，进样量为1.0mg/mL，流速为50μL/min，采集时间为35min。最后利用DataAnalysis软件分析质谱数据。图1中，从市场上购买的α-乳白蛋白，进行SEC纯化后，得到纯化后的α-乳白蛋白；采用IXC-MS对纯化后的α-乳白蛋白进行结构分析。如图2所示，纯化后的α-乳白蛋白存在两个主要的峰(peak1和peak2)。图3和图4所示，采用FTICR-MS对两个峰进行质谱分析，比较相邻峰之间的质量差，可以看出peak1和paek2主要包含了α-乳白蛋白的4个异构体。实施例2本实施例公开了一种快速检测蛋白质异构体的方法，以β-乳球蛋白为例，具体步骤为：1、β-乳球蛋白的纯化：用50mM的醋酸铵溶液平衡分子排阻层析(sizeexclusionchromatography，SEC)柱(TSKgelG3000SWXL，Tosoh，Japan)，然后将β-乳球蛋白溶解于50mM的醋酸铵溶液中，用0.22μm过滤器进行过滤再进样于高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography，HPLC)中。设置参数为：检测波长280nm，流速0.75mL/min，时间20min。最后收集各洗脱峰的蛋白质溶液备用。2、β-乳球蛋白异构体的质谱鉴定：采用十一氟己酸对傅里叶变换离子回旋共振质谱仪((Fouriertransformioncyclotronresonance-MassSpectrometry,FTICR-MS)进行校正，然后将HPLC与质谱仪连接，用50mM的醋酸铵溶液(pH7.0)平衡离子交换层析(ionexchangechromatography，IXC)柱(ProPacSAX-10，ThermoFisherScientific，USA)，将经SEC纯化后的β-乳球蛋白溶液进样于HPLC，进样量为1.0mg/mL，流速为50μL/min，采集时间为35min。最后利用DataAnalysis软件分析质谱数据。图5中，从市场上购买的β-乳球蛋白，进行SEC纯化后，得到纯化后的β-乳球蛋白；采用IXC-MS对纯化后的β-乳球蛋白进行结构分析。如图5所示，纯化后的β-乳球蛋白存在两个主要的峰(peak1和peak2)。图6和图7所示，采用FTICR-MS对两个峰进行质谱分析，比较相邻峰之间的质量差，可以看出peak1和paek2主要包含+6，+7，+8下的质谱峰，选取+8下的质谱峰进行异构体分析。可以看出β-乳球蛋白至少含有20个异构体。以上对本专利技术所提供的技术方案进行了详细介绍，对于本领域的一般技术人员，依据本专利技术实施例的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测蛋白质异构体的方法，其特征在于，包含如下步骤：1、蛋白质的纯化：先用醋酸铵溶液平衡分子排阻层析柱，然后将待检测蛋白质溶解于所述醋酸铵溶液中，用0.22μm过滤器进行过滤，再进样于高效液相色谱中，收集各洗脱峰的蛋白质溶液备用；2、蛋白质异构体的质谱鉴定：采用十一氟己酸对傅里叶变换离子回旋共振质谱仪进行校正，然后将高效液相色谱仪与质谱仪连接，用所述醋酸铵溶液平衡离子交换层析柱，将经纯化后的蛋白质溶液进样于HPLC，最后利用DataAnalysis软件分析质谱数据，检测蛋白质异构体。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测蛋白质异构体的方法，其特征在于，包含如下步骤：1、蛋白质的纯化：先用醋酸铵溶液平衡分子排阻层析柱，然后将待检测蛋白质溶解于所述醋酸铵溶液中，用0.22μm过滤器进行过滤，再进样于高效液相色谱中，收集各洗脱峰的蛋白质溶液备用；2、蛋白质异构体的质谱鉴定：采用十一氟己酸对傅里叶变换离子回旋共振质谱仪进行校正，然后将高效液相色谱仪与质谱仪连接，用所述醋酸铵溶液平衡离子交换层析柱，将经纯化后的蛋白质溶液进样于HPLC，最后利用DataAnalysis软件分析质谱数据，检...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘俊，涂宗财，沙小梅，邵艳红，
申请(专利权)人：江西师范大学，
类型：发明
国别省市：江西,36