精液细胞快速分型检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种精液细胞快速分型检测试剂盒，包括PBS溶液、无钙HBSS缓冲液、固定液、染色试剂及质控品；所述PBS溶液和无钙HBSS缓冲液中均包括牛血清白蛋白、胎牛血清、甘油血清、蛋白、甘油中的一种或多种；所述染色试剂包括细胞通透剂和荧光标记抗体。本发明专利技术还提供了一种利用上述试剂盒进行精液细胞快速分型检测的方法。本发明专利技术可用于精液细胞中生精细胞类型及数量快速判断，进而用于梗阻性还是非梗阻性无精子症的判别，改变我国目前临床上对针对目前精液细胞学的临床评估缺乏快速准确检测试剂的问题，为临床医生进行治疗方案选择时提供指导，切实解决病人的问题。

Rapid typing test kit for semen cells and its detection method

【技术实现步骤摘要】
精液细胞快速分型检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及医疗检测领域，特别涉及一种精液细胞快速分型检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
大数据显示，我国育龄人口约为2.3亿，其中患有不孕不育的人口数约为4000万，男性患者约为1200万，这些患者的检测主要依赖于对精液细胞的分型与监测。精液除精子外，还含有生精上皮脱落细胞、泌尿生殖道脱落细胞等，例如精原细胞、精母细胞、精子细胞、支持细胞、睾丸间质细胞、上皮细胞、白细胞等。对于无精子症患者，可以通过评估精液细胞中生精细胞类型、数量判断是否属于梗阻性还是非梗阻性无精子症。目前，对精液细胞学的评估均通过常规制片、染色，且染色方法多采用改良巴氏或快速染色。单纯通过染色不能快速鉴别细胞类型。因此，如果能通过细胞表面特异性标志物进行荧光标记，将有助于快速识别细胞类型及各细胞分期。流式细胞术(FlowCytometry，FCM)以流式细胞仪为检测手段，通过对靶标分子的特异性荧光标记，能够快速、精确的对单个细胞(或者颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术,因而是解决上述问题的最有力工具，但目前为止，尚未有相关试剂盒出现。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种精液细胞快速分型检测试剂盒及检测方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种精液细胞快速分型检测试剂盒，包括PBS溶液、无钙HBSS缓冲液、固定液、染色试剂及质控品；所述PBS溶液和无钙HBSS缓冲液中均包括牛血清白蛋白、胎牛血清、甘油血清、蛋白、甘油中的一种或多种；所述染色试剂包括细胞通透剂和荧光标记抗体。优选的是，所述PBS溶液还包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾和去离子水。优选的是，所述无钙HBSS缓冲液还包括氯化钾、磷酸二氢钾、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸氢二钠、葡萄糖、乙二胺四乙酸和去离子水。优选的是，所述无钙HBSS缓冲液中还包括氢氧化钠或盐酸。优选的是，所述荧光标记抗体为经荧光染料标记后的抗体，用于鉴别细胞类型；其中，所述抗体包括：用于识别白细胞的CD45、用于识别上皮细胞的EpCAM、CK18或CK19及用于识别精原细胞的SCA、DAZL或TRA98；其中，所述荧光染料包括APC、FITC、PerCP、PI中的一种或多种，所述荧光染料与抗体可任意匹配。优选的是，所述质控品为鸡红细胞。优选的是，所述固定液为经-20℃过夜处理后的冰乙醇。优选的是，所述固定液中还包括牛血清白蛋白、胎牛血清、甘油血清、蛋白、甘油中的一种或多种。优选的是，所述PBS溶液中还包括5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、季铵盐、TritonX-100和二甲亚砜。本专利技术还提供一种利用上述试剂盒进行精液细胞快速分型检测的方法，包括以下步骤：1)获取新鲜精子样品，离心，去上清，加入无钙HBSS缓冲液或含EDTA的PBS溶液，再离心备用，不能立即使用的固定于固定液中；2)步骤1)处理后的精子样品，经无钙HBSS缓冲液洗涤后，在无钙HBSS缓冲液中调整终细胞浓度，再加入染色试剂，进行细胞染色；3)采用流式细胞仪进行检测，以对精子样品中的细胞类型进行识别，其中采用鸡红细胞作为质控品。本专利技术的有益效果是：本专利技术的精液细胞快速分型检测试剂盒可用于精液细胞中生精细胞类型及数量快速判断，进而用于梗阻性还是非梗阻性无精子症的判别，改变我国目前临床上对针对目前精液细胞学的临床评估缺乏快速准确检测试剂的问题，为临床医生进行治疗方案选择时提供指导，切实解决病人的问题。本专利技术能逐步改变国内流式细胞仪用试剂对进口试剂的依赖，大大降低流式细胞仪的应用成本。本专利技术的试剂盒可在4℃下稳定保存1年以上，具有良好的产品开发潜质。本专利技术提供的利用该试剂盒进行精液细胞快速分型检测的方法具有易于操作、重复性强、成本较低且高通量检测的优点，可为患者及病人提供详实可靠的临床数据。附图说明图1为本专利技术的一种实施例中的新鲜分离的精子细胞；图2为本专利技术的一种实施例中的鸡红细胞(RBC)与倍体细胞在流式上的检测结果；图3为本专利技术的一种实施例中的精液细胞流式检测结果。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。本实施例的一种精液细胞快速分型检测试剂盒，包括PBS溶液、无钙HBSS缓冲液、固定液、染色试剂及质控品。所述PBS溶液和无钙HBSS缓冲液中均包括牛血清白蛋白、胎牛血清、甘油血清、蛋白、甘油中的一种或多种，以防止核膜在震荡中破碎。其中，所述PBS溶液还包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾和去离子水。其中，所述无钙HBSS缓冲液还包括氯化钾、磷酸二氢钾、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸氢二钠、葡萄糖、乙二胺四乙酸和去离子水。所述无钙HBSS缓冲液中还包括氢氧化钠或盐酸，以调节pH。所述染色试剂包括细胞通透剂和荧光标记抗体。所述荧光标记抗体为经荧光染料标记后的抗体，用于鉴别细胞类型；其中，所述抗体包括：用于识别白细胞的CD45、用于识别上皮细胞的EpCAM、CK18或CK19及用于识别精原细胞的SCA、DAZL或TRA98；所述荧光染料包括APC(别藻蓝蛋白)、FITC(异硫氰酸荧光素)、PerCP(多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物)、PI(碘化丙啶)中的一种或多种，所述荧光染料与抗体可任意匹配。还可选择其他具有相同发射光谱的量子点的荧光染料。其中，CD45：白细胞共同抗原，EpCAM：上皮细胞粘附分子，CK18/19：细胞角蛋白，SCA：精子包被抗原，DAZL：精子发生蛋白，TRA98：精子特异性抗原。精液中各细胞的分辨方法为：精子细胞或精子对应为1倍体，初级精母细胞对应为4倍体，白细胞对应CD45，上皮细胞对应EpCAM、CK18或CK19，精原细胞对应SCA、DAZL或TRA98。所述质控品为鸡红细胞。鸡红细胞在流式细胞仪上检测峰与精子单倍体峰基本吻合，可用于确定精子细胞位置。鸡红细胞的具体制作方法可参见专利201610242531.0。其中，固定液不可含醛，因会导致细胞聚团。在一种优选实施例中，固定液为经-20℃过夜处理后的冰乙醇，优选为体积分数为70％的冰乙醇。所述固定液中还包括牛血清白蛋白、胎牛血清、甘油血清、蛋白、甘油中的一种或多种，能防止核膜在震荡中破碎。在一种实施例中，PBS溶液配方为：磷酸二氢钾0.27g、磷酸氢二钠1.42g、氯化钠8g和氯化钾0.2g，加1L去离子水溶解，溶液终PH为7.4±0.05；无钙HBSS缓冲液配方为：氯化钾0.4g、磷酸二氢钾0.06g、碳酸氢钠0.35g、氯化钠8g、磷酸氢二钠0.048g、葡萄糖1g和乙二胺四乙酸(EDTA)0.29g，溶解于1L去离子水中，氢氧化钠或盐酸溶液调节PH至7.4±0.05；固定液为70％乙醇，其配方为：75ml乙醇与25ml超纯水混合，置于-20度过夜。在另一种实施例中，PBS溶液和无钙HBSS缓冲液中还包括质量分数为1-10％的牛血清白蛋白或胎牛血清或甘油血清、蛋白或甘油。在另一种实施例中，固定液中还包括质量分数为1-10％的牛血清白蛋白或胎牛血清或甘油血清本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种精液细胞快速分型检测试剂盒，其特征在于，包括PBS溶液、无钙HBSS缓冲液、固定液、染色试剂及质控品；所述PBS溶液和无钙HBSS缓冲液中均包括牛血清白蛋白、胎牛血清、甘油血清、蛋白、甘油中的一种或多种；所述染色试剂包括细胞通透剂和荧光标记抗体。

【技术特征摘要】
1.一种精液细胞快速分型检测试剂盒，其特征在于，包括PBS溶液、无钙HBSS缓冲液、固定液、染色试剂及质控品；所述PBS溶液和无钙HBSS缓冲液中均包括牛血清白蛋白、胎牛血清、甘油血清、蛋白、甘油中的一种或多种；所述染色试剂包括细胞通透剂和荧光标记抗体。2.根据权利要求1所述的精液细胞快速分型检测试剂盒，其特征在于，所述PBS溶液还包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾和去离子水。3.根据权利要求2所述的精液细胞快速分型检测试剂盒，其特征在于，所述无钙HBSS缓冲液还包括氯化钾、磷酸二氢钾、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸氢二钠、葡萄糖、乙二胺四乙酸和去离子水。4.根据权利要求3所述的精液细胞快速分型检测试剂盒，其特征在于，所述无钙HBSS缓冲液中还包括氢氧化钠或盐酸。5.根据权利要求4所述的精液细胞快速分型检测试剂盒，其特征在于，所述荧光标记抗体为经荧光染料标记后的抗体，用于鉴别细胞类型；其中，所述抗体包括：用于识别白细胞的CD45、用于识别上皮细胞的EpCAM、CK18或CK19及用于识别精原细胞的SCA、DAZL或TRA98；其中，所述荧光染料包括APC、FITC、PerCP、PI中的一种或多种，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷建，尹焕才，田晶晶，陈名利，刘荻，茹静，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32