一种膀胱癌的新型基因诊断试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种膀胱癌的新型基因诊断试剂盒及其应用。具体地，本发明专利技术提供了一种检测试剂组合的用途，其特征在于，用于制备一试剂盒，所述试剂盒用于诊断膀胱癌；其中，所述检测试剂组合包括：a)特异性检测人POU4F2基因的DNA甲基化水平的检测试剂；和b)特异性检测人TWIST1基因的DNA甲基化水平的检测试剂；并且，所述试剂盒的使用对象是亚洲人群。本发明专利技术所提供的技术方案中，所需样本为被检者尿液，具有快速、灵敏、无创检测的优点。

A New Kit for Gene Diagnosis of Bladder Cancer and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种膀胱癌的新型基因诊断试剂盒及其应用
本专利技术属于基因诊断领域，更具体地，本专利技术涉及一种膀胱癌的新型基因诊断试剂盒及其应用。
技术介绍
膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位，组织学分类可分为移行细胞癌(90％)、鳞状细胞癌(5％)和腺癌(1％-2％)三种。移行细胞癌又分为非肌肉侵入型膀胱癌(NMIBC)(70％)(pTa、pTis、pT1)和肌肉侵入型膀胱癌(MIBC)(30％)(pT2、pT3、pT4)。根据癌细胞分化程度不同，又将移行细胞癌分为Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级(GradeⅠ、Ⅱ、Ⅲ)。膀胱癌可发生于任何年龄，甚至于儿童。其发病率随年龄增长而增加，高发年龄50-70岁。男性膀胱癌发病率为女性的3-4倍。膀胱癌患者约有80％的患者会出现无痛血尿。在到访泌尿科门诊的血尿病人中，有3％-28％的患者被诊断为膀胱癌。目前对膀胱癌的检查主要采用细胞学检测和膀胱镜检查。两种方法对于检测低级别的肿瘤(Ta、T1、Grade1)，灵敏度都较低，而且膀胱镜检查是一种侵入性而且不舒服的过程。乳头状非侵入性膀胱癌(pTa和pT1)中，有高达50％-70％的患者术后会复发，并且这其中有10％-20％患者会发展成侵入性膀胱癌。目前，监测方案为，前2年中，每3-6个月进行一次膀胱镜检查，在之后每年进行两次的膀胱镜检查。从诊断到死亡，频繁的经尿道切除术和随访膀胱镜检查使膀胱癌成为世界上最昂贵的癌症，发展膀胱癌的无创诊断成为一种迫切的需要。DNA甲基化作为一种新型分子标志，在肿瘤诊断中的重要性日益受到重视。在脊椎动物CpG岛会发生胞嘧啶5'位的甲基化，在人类肿瘤中CpG岛异常的甲基化已经显示会引起肿瘤抑制基因的转录沉默。在临床样本中，检测低拷贝的甲基化DNA是非常具有挑战性的，甲基化特异的定量PCR(qMSP)能够在亚硫酸氢盐修饰后的大量非甲基化序列中特异性地扩增甲基化的DNA靶序列。膀胱组织脱落的肿瘤细胞会进入到尿液中，用定量qMSP的方法在尿液样本中检测脱落细胞的DNA甲基化成为膀胱癌早期诊断的可能方法。然而，现有的通过检测DNA甲基化来诊断膀胱癌的技术中，准确率仍然较低，存在大量的假阳性或假阴性，以致膀胱癌误诊甚至会耽误膀胱癌患者的即时治疗。因此，本领域迫切需要开发一种准确率高、易操作、灵敏度高的膀胱癌的诊断技术。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种准确率高、易操作、灵敏度高的膀胱癌的诊断技术。在本专利技术的第一方面，提供了一种检测试剂组合的用途，用于制备一试剂盒，所述试剂盒用于诊断膀胱癌；其中，所述检测试剂组合由以下DNA甲基化水平检测试剂组成：a)特异性检测人POU4F2基因的DNA甲基化水平的检测试剂；和b)特异性检测人TWIST1基因的DNA甲基化水平的检测试剂；并且，所述试剂盒的使用对象是亚洲人群。在另一优选例中，所述试剂盒的使用对象是中国人群。在另一优选例中，所述试剂盒的使用对象是汉族人群。在另一优选例中，所述试剂盒的使用对象不包括白种人群和黑种人群在另一优选例中，所述膀胱癌包括：移行细胞癌、膀胱鳞状细胞癌和腺癌。在另一优选例中，所述移行细胞癌包括：非肌肉侵入型膀胱癌(NMIBC)(pTa、pTIS、pT1)和肌肉侵入型膀胱癌(MIBC)(pT2、pT3、pT4)。在另一优选例中，所述膀胱癌为移行细胞癌。在一个优选例中，所述的DNA甲基化序列含有CpG二核苷酸结构，并且CpG二核苷酸结构的C碱基带有甲基基团。在另一优选例中，所述特异性检测人POU4F2基因的DNA甲基化水平的检测试剂包括：针对人POU4F2基因的引物对和探针。在另一优选例中，所述针对人POU4F2基因的引物对和探针是针对修饰后的人POU4F2基因序列的引物对和探针。在另一优选例中，所述修饰包括：亚硫酸氢盐修饰、重亚硫酸氢盐修饰、肼盐修饰，或其组合。在另一优选例中，所述修饰为亚硫酸氢盐修饰。在另一优选例中，所述修饰后的人POU4F2基因序列如SEQIDNO:2所示。在另一优选例中，所述针对人POU4F2基因的引物对为序列如SEQIDNO:13和14所示的引物对。在另一优选例中，所述针对人POU4F2基因的探针序列包括如SEQIDNO:15所示的序列。在另一优选例中，所述针对人POU4F2基因的探针还包括可检测标记。在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：荧光基团、放射性元素、酶、化学发光剂胶体金，或其组合。在另一优选例中，所述可检测标记包括位于所述探针的5'端的荧光基团，所述荧光基团包括：FAM、HEX、CY5、CY3、VIC、JOE、TET、5-TAMRA、ROX、TexasRed-X，或其组合。在另一优选例中，所述可检测标记还包括位于所述探针的3'端的猝灭基团，所述荧光基团包括：BHQ、TAMRA、DABCYL、DDQ，或其组合。在另一优选例中，所述针对人POU4F2基因的探针包括位于其5'端的荧光基团和位于其3'端的猝灭基团。在另一优选例中，所述荧光基团为FAM，并且所述猝灭基团为BHQ1。在另一优选例中，所述特异性检测人TWIST1基因的DNA甲基化水平的检测试剂包括：针对人TWIST1基因的引物对和探针。在另一优选例中，所述针对人TWIST1基因的引物对和探针是针对修饰后的人TWIST1基因序列的引物对和探针。在另一优选例中，所述修饰后的人TWIST1基因序列如SEQIDNO:4所示。在另一优选例中，所述针对人TWIST1基因的引物对为序列如SEQIDNO:19和20所示的引物对。在另一优选例中，所述针对人TWIST1基因的探针序列包括如SEQIDNO:21所示的序列。在另一优选例中，所述针对人TWIST1基因的探针还包括可检测标记。在另一优选例中，所述针对人TWIST1基因的探针包括位于其5'端的荧光基团和位于其3'端的猝灭基团。在另一优选例中，所述荧光基团为VIC，并且所述猝灭基团为BHQ1。在另一优选例中，所述针对人POU4F2基因的探针所包括的荧光基团和针对人TWIST1基因的探针所包括的荧光基团是不同的荧光基团。在本专利技术的第二方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：用于诊断膀胱癌的检测试剂组合，所述检测试剂组合由以下DNA甲基化水平检测试剂组成：a)特异性检测人POU4F2基因的DNA甲基化水平的检测试剂；和b)特异性检测人TWIST1基因的DNA甲基化水平的检测试剂；并且，所述试剂盒包括：(i)第一容器，以及位于第一容器中的所述特异性检测人POU4F2基因的DNA甲基化水平的检测试剂；和(ii)第二容器，以及位于第二容器中的所述特异性检测人TWIST1基因的DNA甲基化水平的检测试剂。在另一优选例中，所述特异性检测人POU4F2基因的DNA甲基化水平的检测试剂包括：针对人POU4F2基因的引物对和探针。在另一优选例中，所述特异性检测人TWIST1基因的DNA甲基化水平的检测试剂包括：针对人TWIST1基因的引物对和探针。在另一优选例中，所述试剂盒的第一容器和/或第二容器中，还包括：特异性检测内参基因的检测试剂。在另一优选例中，所述的内参基因用于指示DNA提取和修饰的质量。在另一优选例中，所述内参基因为：β-actin基因。在另一优选例中，所述特异性检测内参基因的检测试剂包括：针对β本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测试剂组合的用途，其特征在于，用于制备一试剂盒，所述试剂盒用于诊断膀胱癌；其中，所述检测试剂组合由以下DNA甲基化水平检测试剂组成：a)特异性检测人POU4F2基因的DNA甲基化水平的检测试剂；和b)特异性检测人TWIST1基因的DNA甲基化水平的检测试剂；并且，所述试剂盒的使用对象是亚洲人群。

【技术特征摘要】
1.一种检测试剂组合的用途，其特征在于，用于制备一试剂盒，所述试剂盒用于诊断膀胱癌；其中，所述检测试剂组合由以下DNA甲基化水平检测试剂组成：a)特异性检测人POU4F2基因的DNA甲基化水平的检测试剂；和b)特异性检测人TWIST1基因的DNA甲基化水平的检测试剂；并且，所述试剂盒的使用对象是亚洲人群。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述特异性检测人POU4F2基因的DNA甲基化水平的检测试剂包括：针对人POU4F2基因的引物对和探针。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述针对人POU4F2基因的引物对为序列如SEQIDNO:13和14所示的引物对。4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述针对人POU4F2基因的探针序列包括如SEQIDNO:15所示的序列。5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述特异性检测人TWIST1基因的DNA甲基化水平的检测试剂包括：针对人TWIST1基因的引物对和探针。6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述针对人TWIST1基因的引物对为序列如SEQIDNO:19和20所示的引物对。7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述针对人TWIST...

【专利技术属性】
技术研发人员：董文华，
申请(专利权)人：上海透景生命科技股份有限公司，上海透景诊断科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31