has-miR-3656作为食管鳞癌分子标志物的应用制造技术

本发明专利技术公开了has‑miR‑3656作为食管鳞癌分子标志物的应用。本发明专利技术通过临床数据分析及构建慢病毒侵染肿瘤细胞模型的实验，证明has‑miR‑3656在食管鳞癌中异常高表达并具有显著促进肿瘤发生发展的作用，即has‑miR‑3656可作为促癌基因，参与是食管鳞癌的发生发展。因此，has‑miR‑3656可在预防与治疗食管鳞癌疾病中作为新的肿瘤标志物，用于临床诊断及预防检测，同时has‑miR‑3656可作为肿瘤治疗的分子靶标，为研制抗肿瘤新药开辟新的途径，具有很好的实际应用价值。

The application of has-mir-3656 as a molecular marker of esophageal squamous cell carcinoma

【技术实现步骤摘要】
has-miR-3656作为食管鳞癌分子标志物的应用
本专利技术属于生物分子标志物检测领域，特别涉及has-miR-3656作为食管鳞癌分子标志物的应用。
技术介绍
食管癌是一种常见恶性肿瘤，食管癌典型的症状为进行性咽下困难，先是难咽干的食物，继而是半流质食物，最后水和唾液也难以咽下。而食管鳞癌(esophagealsquamouscellcarcinoma，ESCC)是发生于食管，向鳞状上皮分化的恶性肿瘤，是食管癌的主要病理类型。虽然目前治疗食管癌的手段有多种，但不论手术、放疗还是化疗，其疗效差、生存率低且早期食管癌不易发现。因此，寻找食管鳞癌疾病中的肿瘤标志物具有重要意义。MicroRNA(miRNA)是近年来发现的一类内源性非编码单链RNA，其长约为18～25个核苷酸。miRNA在生物体内普遍存在，它们通过与mRNA不完全互补结合，使mRNA降解或抑制其翻译，从而参与转录后基因表达调控。一个miRNAs来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达，是复杂的调节网络。在人类基因中占比约2％～3％的miRNAs参与多达30％的基因调控，超过50％的miRNAs位于恶性肿瘤基因的调控区域，人体内miRNAs失衡是恶性肿瘤发病的重要机制。越来越多的证据表明，microRNA可作为一种癌基因或抑癌基因，参与调控多种癌症的发生和发展过程。因此，探索一种能够用于临床诊断及预防检测食管鳞癌的MicroRNA具有重要现实意义。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供has-miR-3656作为食管鳞癌分子标志物的应用。本专利技术的另一目的在于提供has-miR-3656在制备用于诊断食管鳞癌的试剂盒、试纸、芯片或高通量测序平台中的应用。本专利技术的另一目的在于提供has-miR-3656在制备预防和/或治疗食管鳞癌的药物中的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：has-miR-3656作为食管鳞癌分子标志物的应用。所述的has-miR-3656为血清外泌体(Exosome)内的has-miR-3656，其核苷酸序列如下(SEQIDNO.1)所示：ggcgggugcgggggugg。所述的has-miR-3656可以是天然或人工合成的has-miR-3656，或者使用可以表达has-miR-3656的DNA片段的载体转染细胞获得。所述的载体包括病毒载体。所述的病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于慢病毒载体。has-miR-3656在制备用于诊断食管鳞癌的试剂盒、试纸、芯片或高通量测序平台中的应用。一种食管鳞癌生物分子标志物，为has-miR-3656。用于检测血清外泌体内has-miR-3656表达水平(表达量)的试剂在制备诊断食管鳞癌的试剂盒或试纸中的应用。一种快速诊断食管鳞癌的试剂盒，该试剂盒中含有对血清外泌体内has-RNA-3656表达量进行定量检测的试剂。has-miR-3656在制备预防和/或治疗食管鳞癌的药物中的应用。所述的药物还包括药物学上可以接受的载体，包括稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂、或吸附载体。has-miR-3656的抑制剂在制备预防和/或治疗食管鳞癌的药物中的应用。has-miR-3656作为食管鳞癌的生物分子标志物在筛选治疗食管鳞癌的药物中的应用。has-miR-3656作为药物靶点在制备治疗食管鳞癌的药物中的应用。本专利技术的研究基础：1、本专利技术通过临床数据分析发现食管鳞癌样本中hsa-miR-3656异常高表达。2、本专利技术通过检测血清外泌体分析发现hsa-miR-3656异常高表达。3、本专利技术成功构建了慢病毒侵染肿瘤细胞并建立了裸鼠移植瘤模型发现hsa-miR-3656和具有显著促进食管鳞癌发生发展的作用。4、本专利技术表明microRNA在临床实践中有非常重要的意义，将成为新一代的肿瘤生物诊断标志物和用于肿瘤治疗的分子靶标。尤其是开辟了以hsa-miR-3656为主的肿瘤疾病全新靶标的研究，也为研制抗肿瘤新药开辟新的途径。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：本专利技术通过临床数据分析及构建慢病毒侵染肿瘤细胞模型的实验证明has-miR-3656在食管鳞癌中异常高表达并具有显著促进肿瘤发生发展的作用，即has-miR-3656可作为促癌基因，参与是食管鳞癌的发生发展。因此，hsa-miR-3656很可能在预防与治疗食管鳞癌疾病中作为新的肿瘤标志物，可用于临床诊断及预防检测，具有很好的实际应用价值。附图说明图1是Kaplan–Meier分析hsa-miR-3656在食管癌中的表达与预后关系图。图2是qPCR实验检测食管鳞癌患者与健康人血清外泌体中hsa-miR-3656的表达。图3是电镜观察及qPCR实验检测过表达hsa-miR-3656细胞的绿色荧光表达量图；其中，A是ESCC细胞过表达hsa-miR-3656后细胞的绿色荧光表达情况；B是qPCR实验检测ESCC细胞过表达hsa-miR-3656后的hsa-miR-3656的表达情况。图4是过表达hsa-miR-3656细胞接种于裸鼠形成ESCC移植瘤后肿瘤的生长情况及qPCR实验检测肿瘤中hsa-miR-3656的表达图；其中，A是过表达hsa-miR-3656ESCC细胞形成的移植瘤形态；B是移植瘤体积变化情况；C是移植瘤重量；D移植瘤内miR-3656表达情况。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本专利技术所用试剂和原材料均可通过市售获得。实施例1：1、为探讨肿瘤微环境分泌的外泌体对肿瘤细胞生物学功能发挥所依赖的分子基础，我们抽提食管鳞癌肿瘤微环境中肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)来源的外泌体(CDEs)及正常成纤维细胞(外泌体是培养肿瘤相关成纤维细胞及正常成纤维细胞后提取的，肿瘤相关成纤维细胞及正常成纤维细胞来自广州肿瘤医院提供的临床组织标本)(NFs)来源的外泌体(NDES)并对其sRNA进行测序(CAFs和NFs本实验室进行分离和鉴定获得)，获得具显著差异表达的miR-3656。外泌体抽提采用试剂盒并参考说明书进行(外泌体提取试剂盒购买于SBI公司)，具体方式如下：(1)收集培养细胞后的上清液：上述两种细胞分别用含10％(v/v)FBS(胎牛血清)的DMEM培养基培养至融合度为50％，后更换无血清培养基培养24小时后收集上清。之后用无血清培养基与含10％(v/v)FBS的DMEM培养基每24小时交替培养，收集无血清培养基培养后的上清；(2)纯化上清液：将收集得到的上清液在4℃、200g条件下离心10min以除漂浮细胞，然后再4℃、2000g条件下离心15min以除细胞碎片，再用孔径为0.22um的小滤器过滤除大颗粒；(3)浓缩上清液：将步骤(2)中纯化后的上清液移入100KD离心柱(即100KD超滤浓缩柱)，3000g离心15mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.has‑miR‑3656作为食管鳞癌分子标志物的应用。

【技术特征摘要】
1.has-miR-3656作为食管鳞癌分子标志物的应用。2.根据权利要求1所述的has-miR-3656作为食管鳞癌分子标志物的应用，其特征在于：所述的has-miR-3656为血清外泌体内的has-miR-3656，其核苷酸序列如下SEQIDNO.1所示。3.has-miR-3656在制备用于诊断食管鳞癌的试剂盒、试纸、芯片或高通量测序平台中的应用。4.一种食管鳞癌生物分子标志物，其特征在于：为has-miR-3656。5.用于检测血清外泌体内has-miR-3656表达水平的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈小佳，洪岸，金媛，郭淑军，张逸波，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44