新型启动子及其应用制造技术

本发明专利技术涉及新型启动子、包含该启动子的载体、包含该启动子或该载体的微生物以及使用该微生物生产目标产物的方法。

New Promoter and Its Application

【技术实现步骤摘要】
新型启动子及其应用
本公开涉及新型启动子、包含该启动子的载体、包含该启动子或载体的微生物以及使用该微生物生产目标产物的方法。
技术介绍
已经进行不断的努力来使用微生物以高滴度生产目标产物，如氨基酸或包括饲料、药物、食品等的可用于各种目的的有用物质(韩国专利号10-0924065)。作为此类方法中的一种，存在诱导微生物中目标基因的过表达的方法，并且对于此目的而言，高效的基因表达系统是必需的。由于启动子是重要地参与基因表达系统的因素之一，因此对有用启动子的开发是必要的。大肠杆菌(E.coil)来源的tac启动子被广泛认为是强启动子。就棒状微生物而言，通过修饰自身基因的启动子来开发强启动子(Gene,102,93-98,1991；Microbiology,142,1297-1309,1996)。例如，就源自产氨棒状杆菌(Corynebacteriumammoniagenesis)的启动子而言，公开了与大肠杆菌中报道的tac启动子相比有约10％的提高(Biotechnol.Lett.25,1311-1316,2003)。此外，作为源自产氨棒状杆菌的强启动子，开发出具有不同强度的Pcj1至Pcj7启动子，并且它们具有比tac启动子高至少10倍的强启动子活性(韩国专利号10-0620092)。此外，开发出由谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)合成而具有强启动子活性的Po2启动子(韩国专利号10-1632642)。然而，由于与大肠杆菌的基因表达系统相比在棒状杆菌(Corynebacterium)中表现出高表达效果的系统是必要的，所以仍需要开发启动子。在该情况下，本专利技术人已经做出许多努力来找到可以强有力地诱导棒状杆菌属微生物中的基因表达的启动子。结果，他们已经开发出本公开的新型的合成启动子，并证实与已知的启动子相比，该启动子具有更高的表达活性，从而完成本公开。
技术实现思路
技术问题本公开的目的是提供具有启动子活性的新型核酸分子；含有该核酸分子和目标基因的基因表达盒；含有该核酸分子或基因表达盒的重组载体；含有该启动子或载体的重组微生物；以及使用该重组微生物生产目标产物的方法。技术方案为了实现本公开的目的，本公开一方面提供了由选自SEQIDNO:1至3的任何一个核苷酸序列组成的具有启动子活性的核酸分子。如本公开所使用的，术语“启动子”是指位于编码区上游的非翻译核酸序列，其包括聚合酶结合位点，并且具有启动将位于启动子下游的基因转录成mRNA的活性，即聚合酶所结合的并启动基因转录的DNA结构域。启动子可位于mRNA转录起始结构域的5'结构域。在本公开中，由选自SEQIDNO:1至3的任何一个核苷酸序列(即，SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的核苷酸序列)组成的具有启动子活性的核酸分子被分别命名为SPL1、SPL7和SPL13。具有启动子活性的核酸分子也可命名为启动子，并且上述所有术语都可在本公开中使用。本公开的启动子能够表达目标基因，所述目标基因可操作地连接至目标微生物中具有启动子活性的核酸分子，并且可以用作通用(general-use)启动子。此外，本公开的启动子序列可通过常规已知的诱变(例如，直接演化(directevolution)、定点诱变等)进行修饰。因此，启动子可包括而不限于与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的核苷酸序列具有70％或更高、具体地80％或更高、更具体地90％或更高、甚至更具体地95％或更高、甚至还更具体地98％或更高、并且最具体地99％或更高的同源性，并且具有相似启动子活性的任何核苷酸序列。此外，其中部分序列被缺失、修饰、取代或插入的具有上述同源性的任何核苷酸序列应被理解为包括在本公开核酸分子的范围内，只要该序列具有启动子活性。具体地，“由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的核苷酸序列组成”的表述不排除当通过连接到目标基因使用相应的启动子时，在使用限制酶的同时将其连接到目标基因时可以发生的核苷酸的添加和/或缺失和/或修饰等的情形。具体地，除了用于进行基因转录的启动子之外，可以包括用于控制转录的任何操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、和用于控制转录和翻译的序列。例如，适用于原核生物的控制序列可包括任何操纵子序列或核糖体结合结构域，但并不限于此。根据本领域普通技术人员的需要，具有本公开启动子活性的核酸分子可以由上述用于控制基因表达的序列组成。具有启动子活性的由选自SEQIDNO:1至3核苷酸序列的任何一个核苷酸序列组成的核酸分子可包括而不限于可以由已知基因序列制备的探针，例如，在严格条件下通过与本公开的SEQIDNO:1至3的全部或部分核苷酸序列的互补序列杂交而具有本公开启动子活性的任何核苷酸序列。如本文所使用的，术语“同源性”是指两个多核苷酸或多肽部分之间的同一性百分比。可以通过本领域已知的技术测定一个部分与另一部分的序列同源性。例如，可以使用用于计算参数(如分数、同一性和相似性)的标准软件(具体地BLAST2.0)或通过在限定的严格条件下经由Southern杂交实验比较序列来确定同源性，并且可以在相应技术的范围内通过本领域普通技术人员熟知的方法确定限定的适当杂交条件(例如，J.Sambrook等人,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2ndEdition,ColdSpringHarborLaboratorypress,ColdSpringHarbor,NewYork,1989；F.M.Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork)。“严格条件”是指能够在多核苷酸之间进行特定杂交的条件。在参考文献(例如，J.Sambrook等人，同上)中详细描述了该条件。例如，可以包括这样的杂交条件，其中具有高同源性的基因(例如，具有80％或更高、具体地90％或更高、更具体地95％或更高、甚至更具体地97％或更高、甚至还更具体地99％或更高同源性的基因)被杂交，并且具有低于上述的同源性的基因不被杂交；或这样的洗涤条件，其中在对应于Southern杂交的常规洗涤条件的盐浓度和温度的条件下(即60℃，1×SSC和0.1％SDS，具体地60℃，0.1×SSC和0.1％SDS，更具体地68℃，0.1×SSC和0.1％SDS)进行一次，具体地2至3次洗涤。虽然由于杂交的严格性可能发生核苷酸之间的错配，但两个核酸具有互补序列是需要的。术语“互补”用于描述可以相互杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于核苷酸碱基而言，腺苷与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开不仅可以包括基本上相似的核酸序列，而且可以包括与全部序列互补的分离的核酸片段。具体地，可以使用包括Tm值为55℃的杂交条件和上述条件的杂交条件来检测具有同源性的多核苷酸。此外，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但并不限于此，并且可以根据目的由本领域普通技术人员适当地控制。众所周知，多核苷酸杂交的严格性取决于互补性多核苷酸的长度和程度，而且变量是本领域公知的(参见Sambrook等人，同上，9.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.核酸分子，其具有启动子活性，由选自SEQ ID NO:1至3的任何一个核苷酸序列组成。

【技术特征摘要】
2016.08.31 KR 10-2016-01118101.核酸分子，其具有启动子活性，由选自SEQIDNO:1至3的任何一个核苷酸序列组成。2.基因表达盒，其包括权利要求1所述的核酸分子和目标基因。3.重组载体，其包括权利要求1所述的核酸分子或权利要求2所述的基因表达盒。4.棒状杆菌属的重组微生物，其包括权利要求1所述的核酸分子或权利要求3所述的载...

【专利技术属性】
技术研发人员：李英美，李承彬，金成俌，李沚泫，曹承铉，朴承源，张真淑，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国,KR