一种高效体外扩增培养具有高杀伤力的自然杀伤性T细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效体外扩增培养具有高杀伤力的自然杀伤性T细胞的方法，步骤如下：a.取新鲜人外周血，利用梯度离心方法获得单个核细胞；b.在体外培养基中，预刺激单个核细胞；c.扩大培养外周血来源的单个核细胞，检测各类细胞比例，判断目的NK/NKT细胞扩增效率和活力；d.培养3‑4周后，检测目的NK/NKT细胞占细胞群体的比例，检测细胞杀伤效率；e.进一步纯化NK/NKT细胞。本发明专利技术操作简单，获得富含高杀伤活性的NKT细胞的NK细胞群体，该群体不含杂质细胞，避免了杂质细胞导致的免疫原性，临床应用副作用较小。同时具有取材容易来源广泛、适宜大规模培养、对机体损伤小等优点，比较适宜肿瘤患者的辅助治疗。

An efficient method for in vitro expansion and culture of natural killer T cells with high lethality

【技术实现步骤摘要】
一种高效体外扩增培养具有高杀伤力的自然杀伤性T细胞的方法
本专利技术涉及细胞培养
，具体是一种高效体外扩增培养具有高杀伤力的自然杀伤性T细胞的方法。
技术介绍
肿瘤免疫治疗是一种新型的肿瘤治疗模式，它运用细胞因子诱导、抗原诱导、基因改造等多种方法激活免疫细胞，通过这些细胞的激活从而达到肿瘤治疗的目的。肿瘤免疫治疗在恶性肿瘤治疗方面取得了很大的成效，已成为继手术、放疗、化疗三大治疗手段之后的第四种肿瘤治疗方法。从20世纪90年代开始，随着对机体免疫系统的深入了解，肿瘤免疫治疗取得飞速进展，如免疫检验抗体、肿瘤疫苗和嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，CAR)等都在肿瘤治疗领域展现出很好的应用前景。肿瘤免疫治疗的核心是激活肿瘤患者T淋巴细胞(简称T细胞)的抗肿瘤反应，以提高其对肿瘤细胞的杀灭功能。T细胞对肿瘤细胞有明确的靶向性和特异性，能通过识别并聚集到肿瘤抗原表达的部位而产生长程免疫应答反应，直接抑制和杀伤肿瘤细胞。自然杀伤性T细胞（naturekillerTcell，NKT）是一群同时表达T细胞表面标志（CD3）和NK细胞表面标志（CD56）的特殊T细胞群体。NKT细胞通过TCR识别CD1d/脂抗原后，迅速分泌细胞因子，包括IL-4、IL-10和IFN-r等，同时NKT细胞也可以分泌NK细胞特有的穿孔素或通过Fas/FasL杀伤靶细胞。NKT细胞因不需活化即具有细胞毒作用，且抗瘤谱较广而被广泛研究，体外实验证实NKT细胞对多种肿瘤细胞具有杀伤作用。然而由于体内NKT的数量很低，限制了NKT细胞在临床中的应用。研究表明，NKT细胞表面有抑制性受体及活化性受体，通过调节其受体的表达可影响NKT细胞的杀伤活性。因此，如何提高NKT细胞体外扩增效率以及杀伤活性，提高NKT细胞对肿瘤细胞表面抗原的识别，成为解决过继免疫治疗效果的关键问题。肿瘤患者及肿瘤术后患者体内免疫细胞的数量及活性都发生了一定的改变。肿瘤的发生、发展及转移与免疫细胞的抗肿瘤免疫功能被抑制有密切的联系。因此，通过扩增免疫细胞数量、提高免疫细胞活性，可以增强其抗肿瘤效果。NKT细胞作为机体固有免疫系统中重要的组成部分，在肿瘤免疫方面发挥重要作用。目前，NKT细胞体外诱导激活以及扩增方法尚不成熟，使得NKT细胞过继免疫治疗在临床上运用具有很大的局限性。为了更好地将NKT细胞肿瘤免疫治疗用于临床，进一步改善肿瘤患者免疫抑制的状态，在进一步研究NKT细胞抗肿瘤的机制的同时，还要了解肿瘤患者免疫抑制的机理及增强NKT细胞活性的方法，从根本上解决肿瘤患者免疫抑制的问题，为细胞免疫治疗的临床运用提供可靠的理论依据，从而为肿瘤的免疫治疗提供有效的方法。虽然以NK细胞为基础的机体固有免疫疗法在恶性肿瘤的治疗中取得了很大进展，但如何实现同时激活T细胞免疫应答和激活机体固有免疫应答的治疗方法知之甚少。NKT细胞具备了T细胞免疫活性及NK细胞细胞毒性的双重特性。然而，NKT细胞体内含量极低，体外不易扩增获得，这大大限制了NKT细胞的临床应用。因此，在未来肿瘤免疫疗法的研究中，需要探索体外扩增NKT细胞的新实验方法，找到具有更好的抗肿瘤活性的NKT细胞，提高NKT细胞的靶向性来改善肿瘤患者的预后，延长生存时间，提高生活质量，达到更好的治疗癌症的目的。
技术实现思路
本专利技术就是为了解决现有技术的不足，提供一种高效体外扩增培养具有高杀伤力的自然杀伤性T细胞的方法。本专利技术是按照以下技术方案实现的。一种高效体外扩增培养具有高杀伤力的自然杀伤性T细胞的方法，包括以下步骤：a.取新鲜人外周血，利用梯度离心方法获得单个核细胞；b.在体外培养基中，预刺激单个核细胞；c.扩大培养外周血来源的单个核细胞，检测各类细胞比例，判断目的NK/NKT细胞扩增效率和活力；d.培养3-4周后，检测目的NK/NKT细胞占细胞群体的比例，检测细胞杀伤效率；e.进一步纯化NK/NKT细胞。进一步的，一种高效体外扩增培养具有高杀伤力的自然杀伤性T细胞的方法，包括以下步骤：a.取新鲜人外周血，加入羟乙基淀粉，室温放置1-1.5h，留取上清液；将上清液加入到与上清液等体积的淋巴细胞分离液中，离心1800rpm，30℃，15-20分钟；上清液为血清，中间层为淋巴细胞层，分别留取上清液和中间层；b.向淋巴细胞中加入PBS混匀，1800rpm离心10-15分钟，收集沉淀，用NK/NKT细胞培养基重悬，计数；将上述细胞平分为两份，一份加入NK/NKT细胞培养基，另一份加入含4-1BB-L因子的NK/NKT细胞培养基；细胞接种于NK细胞包被液包被过的培养瓶中，37℃，5%CO2，孵育培养；c.扩大培养外周血来源的单个核细胞，检测各类细胞比例，判断目的NK/NKT细胞扩增效率和活力；d.培养3-4周后，检测目的NK/NKT细胞占细胞群体的比例，检测细胞杀伤效率；e.进一步纯化NK/NKT细胞。进一步的，步骤a中外周血与羟乙基淀粉的比例为5:1。进一步的，步骤b中NK/NKT细胞培养基的配置方法为向细胞培养基中加入细胞激活剂和自体血清，配置成含5%自体血清的培养基，过滤后待使用；所述细胞培养基与细胞激活剂的加入比例为1000:1。进一步的，所述自体血清为步骤a中加入淋巴细胞分离液后，离心获得的上清液。进一步的，所获得的自然杀伤性T细胞同时具备CD45抗原表位，CD56抗原表位，CD3抗原表位；NK细胞表面同时具备CD45抗原表位，CD56抗原表位，不具备CD3抗原表位。获得的细胞群体中CD56+细胞含量大于98%，CD3+CD56+细胞含量大于14%。进一步的，所获得的自然杀伤性T细胞具有强烈的杀伤肿瘤细胞能力。进一步的，所获得的自然杀伤性T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。一种高杀伤力的自然杀伤性T细胞，所述自然杀伤性T细胞由上述任一所述的高效体外扩增培养方法获得。一种高杀伤力的自然杀伤性T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用，其所述自然杀伤性T细胞由上述任一所述的高效体外扩增培养方法获得。本专利技术获得了如下的有益效果。本专利技术方法具有原料取材容易，制备方法简单易行，生产效率高的特点，且培养获得的NKT细胞具有效应细胞纯度高，免疫源性低，杀伤肿瘤细胞能力强等优点，在抗击肿瘤方面具有较大潜能和应用价值。附图说明图1是本专利技术体外培养外周血0周流式检测外周血中各类细胞扩增情况图；图2是本专利技术体外培养外周血1周流式检测外周血中各类细胞扩增情况图；图3是本专利技术体外培养外周血2周流式检测外周血中各类细胞扩增情况图；图4是本专利技术体外培养外周血3周流式检测外周血中各类细胞扩增情况图；图5是本专利技术5ml外周血体外培养0-3周NKT细胞扩增情况图；图6是本专利技术NK/NKT细胞杀伤白血病细胞效率图；图7是本专利技术流式检测NK/NKT细胞杀伤白血病细胞效率图；图8是本专利技术NK/NKT细胞杀伤白血病细胞情况图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行进一步说明。实施例1：获得人外周血白细胞取5ml新鲜人外周血，加入羟乙基淀粉（外周血：羟乙基淀粉=5:1），室温放置1h。取上清（白细胞层），除去下层红细胞。在离心管中加入与上清等体积的淋巴细胞分离液，将上清小心转移至分离液之上（轻柔操作避免打破交界液面）；离心1800rpm，30℃，1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效体外扩增培养具有高杀伤力的自然杀伤性T细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：a.取新鲜人外周血，利用梯度离心方法获得单个核细胞；b.在体外培养基中，预刺激单个核细胞；c.扩大培养外周血来源的单个核细胞，检测各类细胞比例，判断目的NK/NKT细胞扩增效率和活力；d.培养3‑4周后，检测目的NK/NKT细胞占细胞群体的比例，检测细胞杀伤效率；e.进一步纯化NK/NKT细胞。

【技术特征摘要】
1.一种高效体外扩增培养具有高杀伤力的自然杀伤性T细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：a.取新鲜人外周血，利用梯度离心方法获得单个核细胞；b.在体外培养基中，预刺激单个核细胞；c.扩大培养外周血来源的单个核细胞，检测各类细胞比例，判断目的NK/NKT细胞扩增效率和活力；d.培养3-4周后，检测目的NK/NKT细胞占细胞群体的比例，检测细胞杀伤效率；e.进一步纯化NK/NKT细胞。2.根据权利要求1所述的一种高效体外扩增培养具有高杀伤力的自然杀伤性T细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：a.取新鲜人外周血，加入羟乙基淀粉，室温放置1-1.5h，留取上清液；将上清液加入到与上清液等体积的淋巴细胞分离液中，离心1800rpm，30℃，15-20分钟；上清液为血清，中间层为淋巴细胞层，分别留取上清液和中间层；b.向淋巴细胞中加入PBS混匀，1800rpm离心10-15分钟，收集沉淀，用NK/NKT细胞培养基重悬，计数；将上述细胞平分为两份，一份加入NK/NKT细胞培养基，另一份加入含4-1BB-L因子的NK/NKT细胞培养基；细胞接种于NK细胞包被液包被过的培养瓶中，37℃，5%CO2，孵育培养；c.扩大培养外周血来源的单个核细胞，检测各类细胞比例，判断目的NK/NKT细胞扩增效率和活力；d.培养3-4周后，检测目的NK/NKT细胞占细胞群体的比例，检测细胞杀伤效率；e.进一步纯化NK/NKT细胞。3.根据权利要求2所述的一种高效体外扩增培养具有高杀伤力的自然杀伤性T细胞的方法，其特征在于：步...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪晓敏，袁胜男，袁卫平，
申请(专利权)人：中国医学科学院血液病医院血液学研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12