用于大鼠肝细胞分离的肝脏灌流方法及其灌流装置制造方法及图纸

本发明专利技术属于动物肝脏灌流分离肝细胞技术领域，具体涉及用于大鼠肝细胞分离的肝脏灌流方法及其灌流装置，该方法根据经典的两步灌注法的原理设计，但在第二步酶液灌流时实时监测大鼠肝脏的重量变化，并在合适时机时自动控制灌流过程停止，灌流装置包括称重平台、灌流系统和数据处理系统，所述灌流系统包括通过输液管依次连接的缓冲液罐、蠕动泵、恒温器、气泡收集器和穿刺针，所述称重平台电性连接数据处理系统，称重平台上放置有大鼠肝脏。本发明专利技术提供了一种可以持续监测灌流过程中肝脏重量变化的灌流装置，可自动在合适时机停止灌流，从而显著提高肝脏灌流后分离获得的肝细胞的活性和数量，具有显著的实质性特点。

Hepatic perfusion method and perfusion device for rat hepatocyte isolation

【技术实现步骤摘要】
用于大鼠肝细胞分离的肝脏灌流方法及其灌流装置
本专利技术涉及动物肝脏灌流分离肝细胞
，具体而言，涉及用于大鼠肝细胞分离的肝脏灌流及其灌流装置。
技术介绍
Seglen在1976年发表了一种用于大鼠肝细胞分离的两步灌注方案。两步灌注的第一步是将不含Ca2+的缓冲液引入肝脏，以去除细胞连接处的Ca2+。这一步是为灌流的第二步做准备。一旦细胞连接被破坏，酶缓冲液被引入肝脏以分解细胞外基质。因此，肝细胞将从细胞连接和细胞外基质中释放出来。在最后阶段，通过轻微机械搅动肝脏以将肝细胞分散到培养基中，可以获得分离的肝细胞悬液。然而，两步灌注的结果对酶缓冲液灌流的持续时间高度敏感。如果酶缓冲液灌流持续时间太短，肝脏细胞外基质不会完全分解。在这种情况下，随后的机械搅拌将导致细胞损伤。如果酶缓冲液灌流时间过长，细胞也会因酶消化过度而受损。酶缓冲液灌流的最佳持续时间很难估计，因为涉及许多因素，包括肝脏大小、酶活性和不同动物间的差异。两步灌注方案已被用于分离各种物种的肝细胞，如大鼠(Quistorff等人1990年，Papeleu等人2006年，Ates等人2012年)，小鼠(Li等人2010年，Liu等人2011年)，马(Shibany等人2016年)，猪(Gerlach等人1994年，Li等人2016年)，鹅(Chunchun等人2013年)和人(Gridelli等人2012年，Lee等人2013年)。此外，美国专利申请公开No.US2003/021593描述了一种基于用于肝细胞分离的两步灌注设计的装置。该装置着重于维持灌流温度，灌流流速，缓冲液的pH，以及维持用于肝细胞分离程序的无菌环境。但是，这些公开文献中均没有提供分离过程的实时监测方法。此外，由于技术不完善，目前使用的两步灌注方案操作过程中会导致细胞获取量少、细胞活力低。从而导致对实验动物和昂贵的消化酶的大量浪费，并阻碍了该技术在较昂贵的实验动物体的应用。同时，由于每次实验中温度、压力、穿刺针固定情况等的差异，均会导致器官所需消化时间的不同，然而这种不同所限定的器官消化时长仅能通过操作人员的经验来把握。例如，当由没有经验的人员进行两步灌注过程时，可能会发生超过70％的灌流失败率。即使由有经验的人员操作，器官的灌流失败率也可能是20-30％左右。实时监测的理念已被用于器官灌流设备的研发。但国内外器官灌流设备的实时监测更多专注于保持灌流压力、温度、流速，缓冲液的pH值等，其目的是保持离体器官的活性，而两步灌流法的目的是从器官分离细胞，因此为这些器官灌流而开发的监测系统不适用于两步灌流法。基于大量的实验数据分析，研究发现灌流过程中肝脏重量与其酶消化程度具有一定相关性，所以提出依据监测灌流过程中肝脏重量变化确定器官的最适灌流时长的方法。因此，研发一种能够实时监测灌流过程中器官重量变化，提高两步灌注过程中细胞存活率的细胞灌流方法和装置具有必要性。
技术实现思路
传统的器官细胞两步灌注分离方法的结果对操作人员经验的依赖程度较高，即使同一操作人员的不同批次的实验结果稳定性亦较低。动物器官的个体差异、实验操作中不可控细节差异等均会影响器官所需要的消化酶液的灌流时间，从而影响细胞的存活率和细胞数量。为了使器官酶液灌流时间有较客观的评价指标，进一步为器官细胞两步灌流分离提供自动化、标准化操作，提高灌流分离原代细胞的存活率与结果稳定性，本专利技术提供用于大鼠肝细胞分离的肝脏灌流方法及其灌流装置。用于大鼠肝细胞分离的肝脏灌流方法，包括以下步骤：(i)用无钙离子缓冲液灌流大鼠肝脏，以破坏器官的细胞连接；(ii)用酶缓冲液灌流大鼠肝脏一段时间，同时使用称重装置对酶缓冲液灌流期间的大鼠肝脏的重量进行持续测定，当大鼠肝脏的重量增加率在预定持续时间内小于或等于预定阀值标准时，停止缓冲液的输送；(iii)将大鼠肝脏移至平皿中，加入基础培养液；(iv)去除大鼠肝脏的包膜等结缔组织，过滤后获得细胞悬液。进一步地，对于步骤(ii)，所述预定持续时间至少为90s，所述重量增加率的预定阀值标准为1％。进一步地，对于步骤(ii)，所述缓冲液的停止输送条件还包括总重量增加率至少为70％。进一步地，对于步骤(ii)，大鼠肝脏的重量测定包括以下步骤：(S1)确定大鼠肝脏的初始重量；(S2)将大鼠肝脏放置在称重平台上，在步骤(ii)开始后，以一定的频率持续检测灌流重量；(S3)将每一个灌流重量进行标准化计算为相对于初始重量的重量变化分数；(S4)使用玻尔兹曼拟合函数对标准化后的数据进行平滑处理；(S5)查找获得最新的平滑处理后的重量数据，并确定该重量数据增加1％后需要经过的时间；(S6)如需要经过的时间小于90s，继续灌流，如需要经过的时间大于90s，进行下一步判断；(S7)如最新的平滑处理后的重量数据小于初始重量的70％，阻碍缓冲液从大鼠肝脏流出持续3s，如大于初始重量的70％，停止灌流。用于大鼠肝细胞分离的肝脏灌流方法的灌流装置，包括称重平台、灌流系统和数据处理系统，所述灌流系统包括通过输液管依次连接的缓冲液罐、蠕动泵、恒温器、气泡收集器和穿刺针，所述称重平台电性连接数据处理系统，称重平台上放置有大鼠肝脏。进一步地，所述称重平台包括置物架，所述置物架中央设置有通孔，所述通孔上设置有筛网，所述筛网上放置有大鼠肝脏，置物架下方连接有称重传感器，所述称重传感器电性连接数据处理系统。进一步地，所述缓冲液罐设置于通孔下方。进一步地，所述数据处理系统为个人电脑，所述数据处理系统电性连接蠕动泵。本专利技术的优点在于：1、自动化程度高，可持续测定灌流的器官重量，自动在合适时机停止灌流。2、获得的细胞存活率较高，细胞总量较多。3、实验步骤简单，同时针对增重不足70％设置了提醒，可提高灌流成功率，避免实验材料浪费。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为灌流装置的结构示意图；图2为称重平台的结构示意图；图3为步骤(ii)的称重程序运行框图；图4为使用玻尔兹曼拟合函数标准化和平滑的权重数据的图表；图5为活细胞回收率与1％平台期持续时间之间的关系图；图6为图5中的数据训练的两级分类器的ROC曲线；图7为活细胞回收率与肝脏重量增加率之间的关系图；图8为图7中的数据训练的二级分类器的ROC曲线。附图标识：1-称重平台，11-置物架，12-通孔，13-筛网，14-称重传感器，21-输液管，22-缓冲液罐，23-蠕动泵，24-恒温器，25-气泡收集器，26-穿刺针，27-第一缓冲液罐，28-三通阀，3-数据处理模块，4-大鼠肝脏。具体实施方式传统的器官细胞两步灌注分离方法的结果对操作人员经验的依赖程度较高，即使同一操作人员的不同批次的实验结果稳定性亦较低。动物器官的个体差异、实验操作中不可控细节差异等均会影响器官所需要的消化酶液的灌流时间，从而影响细胞的存活率和细胞数量。为了使器官酶液灌流时间有较客观的评价指标，进一步为器官细胞两步灌流分离提供自动化、标准化操作，提高灌流分离原代细胞的存活率与结果稳定性，本专利技术提供用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于大鼠肝细胞分离的肝脏灌流方法，其特征在于，包括以下步骤：(i)用无钙离子缓冲液灌流大鼠肝脏，以破坏器官的细胞连接；(ii)用酶缓冲液灌流大鼠肝脏，同时使用称重装置对酶缓冲液灌流期间的大鼠肝脏的重量进行持续测定，当大鼠肝脏的重量增加率在预定持续时间内小于或等于预定阀值标准时，停止缓冲液的输送；(iii)将大鼠肝脏移至平皿中，加入基础培养液；(iv)去除大鼠肝脏的包膜等结缔组织，过滤后获得细胞悬液。

【技术特征摘要】
1.用于大鼠肝细胞分离的肝脏灌流方法，其特征在于，包括以下步骤：(i)用无钙离子缓冲液灌流大鼠肝脏，以破坏器官的细胞连接；(ii)用酶缓冲液灌流大鼠肝脏，同时使用称重装置对酶缓冲液灌流期间的大鼠肝脏的重量进行持续测定，当大鼠肝脏的重量增加率在预定持续时间内小于或等于预定阀值标准时，停止缓冲液的输送；(iii)将大鼠肝脏移至平皿中，加入基础培养液；(iv)去除大鼠肝脏的包膜等结缔组织，过滤后获得细胞悬液。2.根据权利要求1所述的用于大鼠肝细胞分离的肝脏灌流方法，其特征在于，对于步骤(ii)，所述预定持续时间至少为90s，所述重量增加率的预定阀值标准为1％。3.根据权利要求1所述的用于大鼠肝细胞分离的肝脏灌流方法，其特征在于，对于步骤(ii)，所述缓冲液的停止输送条件还包括肝脏重量增加率至少为70％。4.根据权利要求2或3所述的用于大鼠肝细胞分离的肝脏灌流方法，其特征在于，对于步骤(ii)，大鼠肝脏的重量测定包括以下步骤：(S1)确定大鼠肝脏的初始重量；(S2)将大鼠肝脏放置在称重平台上，在步骤(ii)开始后，以一定的频率持续检测灌流重量；(S3)将每一个灌流重量进行标准化计算为相对于初始重量的重量变化分...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄振威，周艳，
申请(专利权)人：广州市冠流生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44