一种抗白介素6的人ScFv单链抗体制造技术

本发明专利技术公开了一种抗白介素6的单链抗体的蛋白质，所述单链抗体具有高度特异性的抗原识别能力，所述单链抗体蛋白既具有抗体的特异性识别作用，同时这种识别性又可以被特异性受体阻断，而且该抗体融合蛋白的分子量小，可以在原核细胞表达系统中表达，大大降低了抗体药物的生产成本。

A Human ScFv Single Chain Antibody Against Interleukin 6

【技术实现步骤摘要】
一种抗白介素6的人ScFv单链抗体
本专利技术公开了一种抗IL6人ScFv单链抗体，属于免疫学和分子生物学领域。
技术介绍
炎症尤其是慢性炎症对机体有着巨大的损害，炎症部位长时间释放大量细胞因子和炎症介质，不仅引起局部组织器官病变，使患者产生痛苦，而且长时间的炎症更容易导致肿瘤发生。在炎症中较为常见的两种细胞因子为肿瘤坏死因子α和白细胞介素6，针对这两个因子研发的抗体药物也已经上市，如治疗类风湿性关节炎的阿达木单抗。白细胞介素-6(Interleukelin-6，IL-6)是具有多种生物学活性的细胞因子，也是机体复杂的细胞因子网络中的关键因子，它可以调节其他细胞因子的作用，在发生炎症、坏死或由于肿瘤细胞抗原刺激免疫细胞分泌IL-6增高等情况下，血清中IL-6增加，过量表达IL-6往往与某些疾病相关(Keto等，1997)。由于IL-6所具有的广泛的生物学活性和潜在的临床应用前景，受到广泛关注，从发现至今国内外学者对其结构、生物学特性、作用机制及临床应用等做了大量研究。单核巨噬细胞是免疫系统的第一道防线，能独立鉴定抗原并提供信息传递，从而诱发免疫反应，在这些过程中释放一系列单核因子包括肿瘤坏死因子(TNFa)、白细胞介素一6(IL-VI)、白细胞介素-1(IL-I)等，亦称前炎性细胞因子。抗体药物已作为炎症患者常规的治疗药物之一，预计2020年，单抗药物的销售额将达到2000亿美元。自从1984年第一个基因工程抗体人-鼠嵌合抗体诞生以来，新型基因工程抗体不断出现，如人源化抗体、单价小分子抗体(Fab、单链抗体、单域抗体、超变区多肽等)、多价小分子抗体(双链抗体，三链抗体，微型抗体)、某些特殊类型抗体(双特异抗体、抗原化抗体、细胞内抗体、催化抗体、免疫脂质体)及抗体融合蛋白(免疫毒素、免疫粘连素)等等。另外，用于制备新型抗体的噬菌体抗体库技术成为继杂交瘤技术之后生命科学研究中又一突破性进展。目前小分子抗体开发成药物主要以两种形式为主，一种是抗体偶联复合物(Antibodyconjugatecomplex，ADC)，另一种是双特异抗体。抗体-药物偶联物是一种新型的靶向治疗，比如抗肿瘤治疗中，ADCs由一个抗体或一个抗体片段ScFv连接着一个有效载荷的药物(通常是毒素)形成一个免疫复合物。抗体使这个免疫复合物结合到特定的肿瘤细胞上，通常这个免疫复合物会内化到肿瘤细胞内部，然后药物释放到细胞内引起肿瘤细胞损伤和死亡。抗体偶联复合物虽然具有很好的肿瘤识别能力和抗瘤效应，但是其制备过程中需要与另外的化学基团偶联，不仅增加了制备成本，还难以保证产物的均一性，偶联的化学基团与抗体的抗原识别区往往还容易产生空间位阻效应，有时对机体还具有毒副作用，这些因素都影响抗体偶联复合物实际的抗瘤效果。最新的肿瘤生物治疗方法CAR-T是目前认为最有效的肿瘤治疗手段。但是这种方法如果运用不当会出现一种非常严重的副反应细胞因子风暴，这种症状还可以出现在外伤、感染等多种疾病中。细胞因子风暴(cytokinestorm)是指机体感染微生物后引起体液中多种细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MCP-1和IL-8等迅速大量产生的现象，是引起急性呼吸窘迫综合症和多器官衰竭的重要原因。如果能在细胞因子大量升高初期及时阻断这些因子的生物学功能，就可减轻对机体的损伤。本专利技术抗白介素6单链抗体识别并阻断IL6的生物学功能，从而达到降低炎症反应的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是研发出一种具有抗炎症反应的单链抗体。基于上述专利技术目的，本专利技术提供了一种抗白细胞介素6的单链抗体，所述抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.1、2和3所示，所述抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.5、6和7所示。在一个优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.4和8所示。在一个更为优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接多肽相连。最后，本专利技术提供了上述双特异抗体在制备抗炎药物中的应用。本专利技术选取具有确定性炎症因子的白细胞介素6IL6入手，利用噬菌体抗体库方法筛选高亲和力抗IL6的ScFv。在结合试验中，单链抗体均各IL6蛋白具有较高水平的亲和力，而且单链抗体与靶蛋白的结合均可以被它们相应的配体阻断。而且由于本专利技术选用的是抗体小分子片段，该双特异性抗体的分子量小，可以在原核细胞表达系统中表达，大大降低了抗体药物的生产成本。附图说明图1.VH和VLPCR产物鉴定图图2.载体图谱和重组载体鉴定图图3.筛选出的抗IL6ScFv与IL6蛋白的结合试验图4.IL6R对IL6ScFv和IL6蛋白结合的阻断试验图5.TNFa-IL6双特异抗体聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定图具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的保护范围构成任何限制。实施例1抗IL6单链抗体的制备1.1高库容量天然抗体库的建立。分离人外周血单个核淋巴细胞：随机选取100个健康成年人，抽取每人外周血10ml。用含10％肝素的RPMI-1640培养液1∶1稀释，加到装有淋巴细胞分离液的离心管(稀释静脉血与淋巴细胞分离液的体积比为2∶1)中，2,000×g，离心17分钟。吸取淋巴细胞分离液界面乳白色单个核细胞层，PBS缓冲液洗两次。1.2细胞总RNA的提取按每5×106cells/ml的比例加入Trizol试剂，吹打细胞使之裂解。室温孵育5min，移入经DEPC处理的EP管中，加入1/5体积的氯仿，剧烈振荡15sec，室温孵育3min。4℃，10,000×g离心15min，吸取上层水相至一个新的离心管中，加入1/2体积的异丙醇，冰浴10min。4℃，12,000×g离心10min，弃上清，加入1ml75％乙醇清洗沉淀。4℃，7,500×g离心5min，弃上清，室温干燥沉淀，溶于无RNase的水或沉淀于无水乙醇内，-80℃保存备用。1.3逆转录合成cDNA第一链先用无RNase的DNaseI处理总RNA以消除残存的基因组DNA。取处理过的RNA样品2μg和Oligo(dT)15(500μg/ml)1μl，补加DEPC水至12μl，70℃，加热10min。取出后马上置于冰浴中，依次加入5×Buffer5μl；dNTP(10mmol/L)5μl；RNA酶抑制剂1μl，MMLV逆转录酶1μl，补加DEPC水至25μl，42℃，保温60min进行逆转录反应，70℃，15min灭活酶活性。1.4PCR扩增VH和VL基因以逆转录合成cDNA第一链为模板，采用人ScFv抗体库引物扩增所表达的VH和VL基因。反应体系如下：PCR参数：94℃变性3min后，再以94℃30sec；61℃30sec；72℃1min，进行PCR，共30个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后取5μl反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。PCR产物回收(1)PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，从琼脂糖凝胶上切下目的DNA片段，放入1.5ml离心管中。(2)加入400μl溶胶液A，70℃溶解5分钟，至凝本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗白细胞介素6的单链抗体，其特征在于，所述抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2和3所示，所述抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6和7所示。

【技术特征摘要】
1.一种抗白细胞介素6的单链抗体，其特征在于，所述抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.1、2和3所示，所述抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.5、6和7所示。2.根据权利要求1所述的抗体，其特在在于，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕新军，
申请(专利权)人：江苏莱博德医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32