一种基于带芽茎段为外植体的黑籽南瓜组培繁殖方法技术

本发明专利技术属于突变或遗传工程技术领域，公开了一种基于带芽茎段为外植体的黑籽南瓜组培繁殖方法；选择大小一致、饱满的黑籽南瓜种子；选择无菌苗上生长健壮的带芽茎段作为外植体；切取长度为1cm的生长健壮的带芽茎段，接种培养基上，开始分化新的芽，平均每个带芽茎段能分化出3‑7个新芽；将新芽切成单体，接种至壮苗培养基中培养；驯化炼苗，将瓶盖拧开加入灭菌水，盖上保鲜膜，培养箱中放置，加入蒸馏水；将生根苗取出，洗净根部的培养基，移栽至灭过菌的基质中，揭开保鲜膜，按正常栽培管理即可。本发明专利技术通过选择合适的外植体建立高效的组培快繁体系，不仅能缩短育种周期，获得大量优质种苗，同时也能为后续的植株转化奠定基础。

A Tissue Culture and Propagation Method of Black-Seeded Pumpkin Based on Budded Stem Segment as Explant

【技术实现步骤摘要】
一种基于带芽茎段为外植体的黑籽南瓜组培繁殖方法
本专利技术属于突变或遗传工程
，尤其涉及一种基于带芽茎段为外植体的黑籽南瓜组培繁殖方法。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：黑籽南瓜(CucurbitaficifoliaBouché)属于葫芦科，南瓜属，一年或多年生蔓性草本植物，源产于中美、墨西哥南部，其开花期需短日照的植物，生长于海拔高于1000m的地方，且其耐寒性高于其他葫芦科作物。黑籽南瓜作为可食用蔬菜，不仅可以为烹饪提供原材料，在欧洲还可作为观赏植物。经临床试验，其果实提取物还有降低血糖的作用。自上世纪80年代起，黑籽南瓜还常常作为其他瓜类，如黄瓜、西瓜、甜瓜等的砧木，以此来增强其耐寒性、耐盐性和对土传病害的抗性。黑籽南瓜作为其他瓜类砧木，曾有效的控制了枯萎病的发生和蔓延。但是由于农民在栽培时不注意自交留种导致种性退化。将抗性基因转入黑籽南瓜，既可以保留抗性，又不会把外源基因导入其他瓜类，而高效的黑籽南瓜组培快繁体系是转化成功的先决条件之一。目前黑籽南瓜组织培养使用的外植体主要是子叶、下胚轴或者茎尖，而以带芽茎段为外植体的黑籽南瓜组培暂时无相关报道；获得不定芽的方法有2种：一是先通过脱分化形成愈伤组织，再分化形成不定芽，由于愈伤组织脱分化过程较慢，需要增加1-2个月的时间，所以延长了获得不定芽的时间；二是如果采用茎尖直接分化形成不定芽的途径。但由于黑籽南瓜内源激素的含量和比例问题，导致黑籽南瓜在组培过程中更易分化不定根，从而影响了不定芽分化。所以，黑籽南瓜组织培养中，如何获得适合的激素比例，是建立黑籽南瓜再生体系的关键。综上所述，现有技术存在的问题是：目前黑籽南瓜组织培养的分化周期较长且分化效率不高。解决上述技术问题的难度：黑籽南瓜芽分化效率低与其自身内源激素有关。解决该问题的难点在于找一个内源激素与外源激素的平衡点来促进芽分化。解决上述技术问题的意义：通过建立稳定的黑籽南瓜高效快繁体系，不仅可以解决生产上发芽率低和发芽不整齐的问题，而且还能为开发利用黑籽抗性基因奠定基础。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种基于带芽茎段为外植体的黑籽南瓜组培繁殖方法。本专利技术是这样实现的，一种基于带芽茎段为外植体的黑籽南瓜组培繁殖方法，所述基于带芽茎段为外植体的黑籽南瓜组培繁殖方法包括：第一步，选择大小一致、饱满的黑籽南瓜种子，经0.1％Hgcl浸泡8min，期间不断搅拌，无菌水冲洗2-3次；10％过氧化氢浸泡2h，无菌水冲洗、搅拌5-6次，置于灭过菌的滤纸上吸干水分，播种至1/2MS中，28℃暗培养至露白，转移至25℃，5000lx/18℃，0lx，12h下培养；第二步，选择无菌苗上生长健壮的带芽茎段作为外植体；第三步，切取长度为1cm的生长健壮的带芽茎段，接种培养基上，开始分化新的芽，平均每个带芽茎段能分化出3-7个新芽；第四步，将新芽切成单体，接种至壮苗培养基中，培养1-2个周，得到株高5cm，叶片数6-8片的黑籽南瓜幼苗地上部分；继而转入MS培养基中生根2个周，每个植株的根系可生长至10-20条；第五步，驯化炼苗，待根生长至20-30条时，将瓶盖拧开加入灭菌水，盖上保鲜膜，培养箱中放置2-3d，转到培养箱外放置3-4d，期间慢慢加入蒸馏水；将生根苗取出，洗净根部的培养基，移栽至灭过菌的基质中，覆盖保鲜膜生长1周，揭开保鲜膜，按正常栽培管理即可。进一步，所述第三步中接种至MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖的培养基上，pH5.8，在白天温度为25±2℃，光照强度为5000lx，光照时间为12h/d，夜间温度为18±2℃下培养1-1.5个月。进一步，所述第四步中接种至1/2MS+0.1mg/LPP333的壮苗培养基中，在白天温度为25±2℃，光照强度为5000lx，光照时间为12h/d，夜间温度为18±2℃下培养1-2个周。进一步，所述第五步中灭过菌的基质按照体积比为草炭：珍珠岩＝2:1。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：获得一个高效的黑籽南瓜再生体系(表1)。从表1中可以看出，经过对黑籽南瓜组织培养体系的优化和调整，可以获得更高的增殖系数和生根率。表1本试验在增殖系数及生根率方面与前人的比较附图说明图1是本专利技术实施例提供的基于带芽茎段为外植体的黑籽南瓜组培繁殖方法流程图。图2是本专利技术实施例提供的芽分化的示意图。图3是本专利技术实施例提供的壮苗的示意图。图4是本专利技术实施例提供的移栽成活的示意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。针对目前黑籽南瓜组织培养的分化周期较长且分化效率不高的问题。本专利技术通过选择合适的外植体建立高效的组培快繁体系，不仅能缩短育种周期，获得大量优质种苗，同时也能为后续的植株转化奠定基础。下面结合附图对本专利技术的应用原理作详细的描述。如图1所示，本专利技术实施例提供的基于带芽茎段为外植体的黑籽南瓜组培繁殖方法包括以下步骤：S101：选择大小一致、饱满的黑籽南瓜种子，经0.1％Hgcl浸泡8min，期间不断搅拌，无菌水冲洗2-3次；10％过氧化氢浸泡2h，无菌水冲洗、搅拌5-6次，置于灭过菌的滤纸上吸干水分，播种至1/2MS中，28℃暗培养至露白，转移至25℃，5000lx/18℃，0lx，12h下培养；S102：选择无菌苗上生长健壮的带芽茎段作为外植体；S103：切取长度为1cm左右的生长健壮的带芽茎段，接种至MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖的培养基上，pH5.8左右，在白天温度为25±2℃，光照强度为5000lx，光照时间为12h/d，夜间温度为18±2℃下培养1-1.5个月左右，开始分化新的芽，平均每个带芽茎段能分化出3-7个新芽；S104：将上述新芽切成单体，接种至1/2MS+0.1mg/LPP333的壮苗培养基中，在白天温度为25±2℃，光照强度为5000lx，光照时间为12h/d，夜间温度为18±2℃下培养1-2个周，得到株高5cm左右，叶片数6-8片的黑籽南瓜幼苗地上部分。继而转入MS培养基中生根2个周左右，每个植株的根系可生长至10-20条；S105：驯化炼苗，待根生长至20-30条左右时，将瓶盖拧开加入灭菌水，盖上保鲜膜，培养箱中放置2-3d，转到培养箱外放置3-4d，期间慢慢加入蒸馏水。将生根苗取出，洗净根部的培养基，移栽至灭过菌的基质(草炭：珍珠岩＝2:1)中，覆盖保鲜膜生长1周左右，慢慢揭开保鲜膜，按正常栽培管理即可。本专利技术实施例提供的基于带芽茎段为外植体的黑籽南瓜组培繁殖方法具体包括以下步骤：第一步，无菌苗的获得：选择大小一致、饱满的黑籽南瓜种子，经0.1％Hgcl浸泡8min，期间不断搅拌，无菌水冲洗2-3次；10％过氧化氢浸泡2h，无菌水冲洗、搅拌5-6次，置于灭过菌的滤纸上吸干水分，播种至1/2MS中，28℃暗培养至露白，转移至25℃，5000lx/18℃，0lx，12h下培养。第二步，外植体的选择：选择无菌苗上生长健壮的带芽茎段作为外植体。第三步，诱导芽的分化：切取长度为1cm左右的生长健壮的带芽本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于带芽茎段为外植体的黑籽南瓜组培繁殖方法，其特征在于，所述基于带芽茎段为外植体的黑籽南瓜组培繁殖方法包括：选择大小一致、饱满的黑籽南瓜种子；选择无菌苗上生长健壮的带芽茎段作为外植体；切取长度为1cm的生长健壮的带芽茎段，接种培养基上，开始分化新的芽，平均每个带芽茎段能分化出3‑7个新芽；将新芽切成单体，接种至壮苗培养基中培养；驯化炼苗，将瓶盖拧开加入灭菌水，盖上保鲜膜，培养箱中放置，加入蒸馏水；将生根苗取出，洗净根部的培养基，移栽至灭过菌的基质中，揭开保鲜膜，按正常栽培管理即可。

【技术特征摘要】
1.一种基于带芽茎段为外植体的黑籽南瓜组培繁殖方法，其特征在于，所述基于带芽茎段为外植体的黑籽南瓜组培繁殖方法包括：选择大小一致、饱满的黑籽南瓜种子；选择无菌苗上生长健壮的带芽茎段作为外植体；切取长度为1cm的生长健壮的带芽茎段，接种培养基上，开始分化新的芽，平均每个带芽茎段能分化出3-7个新芽；将新芽切成单体，接种至壮苗培养基中培养；驯化炼苗，将瓶盖拧开加入灭菌水，盖上保鲜膜，培养箱中放置，加入蒸馏水；将生根苗取出，洗净根部的培养基，移栽至灭过菌的基质中，揭开保鲜膜，按正常栽培管理即可。2.如权利要求1所述的基于带芽茎段为外植体的黑籽南瓜组培繁殖方法，其特征在于，所述基于带芽茎段为外植体的黑籽南瓜组培繁殖方法具体包括：第一步，选择大小一致、饱满的黑籽南瓜种子，经0.1％Hgcl浸泡8min，期间不断搅拌，无菌水冲洗2-3次；10％过氧化氢浸泡2h，无菌水冲洗、搅拌5-6次，置于灭过菌的滤纸上吸干水分，播种至1/2MS中，28℃暗培养至露白，转移至25℃，5000lx/18℃，0lx，12h下培养；第二步，选择无菌苗上生长健壮的带芽茎段作为外植体；第三步，切取长度为1cm的生长健壮的带芽茎段，接种培养基上，开始分化新的芽，平均每个带芽茎段能分化出3-7个新芽；第四步，将新芽切成单体，接种至...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨正安，谢俊俊，高婷，丁玉梅，张杰，杜康华，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：云南,53