一种术中快速鉴别甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移的方法技术

本发明专利技术公开一种快速检测人甲状腺球蛋白(Tg)从而快速鉴别甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移的荧光免疫层析试纸，该试纸通过双抗体夹心法和荧光免疫层析技术检测人Tg，所述抗体是利用特定的抗原表位肽制备获得。本发明专利技术能够快速准确地检测待测物中的人Tg，操作简便、快速，检测范围宽、特异性高、灵敏度好。

A rapid intraoperative method for differentiating cervical lymph node metastasis from papillary thyroid cancer

【技术实现步骤摘要】
一种术中快速鉴别甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移的方法
本专利技术属于免疫检测领域，具体涉及人甲状腺球蛋白(Tg)抗原表位肽、用该抗原表位肽制备的Tg特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗体、所述抗体在制备人甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移体外诊断试剂盒上的用途，相关体外诊断试剂盒，以及一种用于术中快速鉴别甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移的荧光免疫层析试纸及其制备方法。
技术介绍
甲状腺癌作为内分泌肿瘤和头颈肿瘤中最常见的恶性肿瘤，发病率是近20多年来增长最快的实体恶性肿瘤。甲状腺癌发病率迅速增长主要归因于分化型甲状腺癌特别是甲状腺乳头病率的迅速增加。约50％的PTC患者在早期或术后随访中都可能发生颈部淋巴结转移。对于PTC颈淋巴结转移，需行颈淋巴结清扫，手术范围较广，对机体损伤较大，在《2015美国甲状腺学会成人甲状腺结节与分化型甲状腺癌诊治指南》及《2012中国甲状腺结节和分化型甲状腺癌指南》建议对于有明确颈淋巴结转移病理学依据的患者进行颈淋巴结清扫。对于PTC患者颈淋巴结转移的判断，在术前主要结合临床症状、体征、B超、CT等影像学检查和淋巴结穿刺细胞学检测。术前无法明确颈淋巴结转移，则需要行术中颈淋巴结冰冻病理学检查。术中淋巴结冰冻病理学检查，依赖于大型的病理学检测设备、专业的病理学医生以及约30分钟的等待时间。Tg是甲状腺滤泡上皮细胞分泌的大分子糖蛋白，由甲状腺细胞合成并释放进入甲状腺滤泡的残腔中。Tg也被认为是甲状腺体形完整性的特殊标志物。在先天性甲状腺功能低下患者，检测Tg可鉴别甲状腺完全缺损、甲状腺发育不全。甲状腺癌多起源于甲状腺滤泡上皮细胞，临床上常见的多为已分化之甲状腺癌，这些已分化的甲状腺癌仍然保有甲状腺滤泡上皮细胞的特性(如摄碘、合成Tg、合成甲状腺过氧化酶等)，其转移也会将上述特性带至转移灶。因此，可以通过检测Tg这一甲状腺特有蛋白的方式来判定甲状腺癌的淋巴结转移情况，进而为外科医师手术时确定淋巴结清扫范围提供有益的指引和帮助。免疫层析技术是出现于80年代初期的一种独特的免疫分析方式，它通常以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体(如抗体或抗原)发生高特异高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测带)，通过酶反应或直接运用可目测的标记物(如胶体金)而得到直观的实验结果(如显示出不同的颜色)。而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。免疫层析技术常见的示踪标记粒子有胶体金，乳胶，胶体硒、明胶等，其中运用最成功的标记物为胶体金。但是，胶体金免疫层析试纸条存在以下缺陷：(1)胶体金标记过程是静电吸附过程，是一种物理吸附，故在液相中稳定性较差，往往造成已标记上的蛋白分子又再次脱落。(2)检测结果通过显示单一的紫红色条带来判断，颜色单一，难以实现多检和联检。(3)只有当金颗粒集聚到一定量时，人肉眼才能观察到紫红的条带，且该颜色条带与背景对比度不大，从而限制了检测灵敏度。(4)不同的材料基质效应明显，背景干扰非常大。(5)检测灵敏度较低。(6)无法实现定量检测。目前也出现了利用量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法，但是此方法并不能实现对检测物的定量检测。此外，在检测Tg水平的免疫测定方法中，尚缺乏能够在双抗体夹心测定中可高灵敏、高特异性检测的组合，寻找更为合适的具有免疫原性的Tg抗原表位肽、制备特异性的Tg抗原及抗体也是需要解决的重点。本申请基于生物信息学、化学合成等技术，获得用于抗体制备的Tg蛋白抗原肽。随后利用该抗原肽制备了单克隆抗体和多克隆抗体，验证了抗体的特异性。结果显示筛选出的抗原肽可以有效地用于针对Tg蛋白的抗体的制备，为Tg水平的免疫测定和快速鉴别甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移提供了重要的工具。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述不足，提供一种高灵敏度和高特异性，批内、批间误差小、操作简单、成本低的快速检测Tg从而在术中快速鉴别甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移的试纸及其应用。具体地，提供一种用于定量检测待测物中人甲状腺球蛋白(Tg)的荧光免疫层析试纸，其中所述试纸具有底板，并且在该底板上沿使用时的层析方向依次以接触方式设置有：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，该试纸通过双抗体夹心法和荧光免疫层析技术检测人Tg，其中：所述双抗体夹心法采用标记有荧光微球的第一TG单克隆抗体作为检测抗体，所述第一Tg单克隆抗体利用人Tg抗原表位肽(1)和(2)中的一个作为抗原制备获得；并且所述双抗体夹心法采用第二Tg单克隆抗体作为捕获抗体，所述第二单克隆抗体利用人Tg抗原表位肽(1)和(2)中的另一个作为抗原制备获得；所述人Tg抗原表位肽(1)和(2)分别为：(1)PKRCPRSCEIRNRRLLHGV(SEQIDNO：2)(2)AERRFQAPEPLNWTGSWDASKPRA(SEQIDNO：3)。优选地，所述结合垫设置有所述标记有荧光微球的第一Tg单克隆抗体。优选地，所述硝酸纤维素膜包括检测带和质控带，所述检测带固定有所述第二Tg单克隆抗体，所述质控带包被有能与所述标记有荧光微球的第一Tg单克隆抗体特异性结合的抗抗体，所述检测带和质控带间隔3mm至8mm。优选地，所述单克隆抗体是由Tg抗原表位肽与载体蛋白偶联制备而成的抗原制备而得。优选地，所述荧光微球上的荧光物质为稀土离子铕。优选地，所述荧光微球的微球材料为聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯的共聚物。优选地，所述底板不具有荧光性质。优选地，所述抗抗体为羊抗鼠IgG单克隆抗体或兔抗鼠IgG单克隆抗体。进一步地，提供一种制备本专利技术所述荧光免疫层析试纸的方法，其包括以下步骤：1)提供标记有荧光微球的第一Tg单克隆抗体；2)提供结合垫，其中在所述结合垫上结合有所述标记荧光微球的第一TG单克隆抗体；3)提供硝酸纤维素膜，其中在所述硝酸纤维素膜上沿使用时的层析方向间隔固定第二Tg单克隆抗体和抗抗体，以分别形成检测区和质控区；4)在底板上沿使用时的层析方向依次以接触方式设置样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素膜、吸水纸，从而制成所述荧光免疫层析试纸。其中所述步骤1)包括：使用pH7.2-7.6的MES活化缓冲液洗涤荧光微球，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温反应一定时间，洗涤荧光微球，用0.05MpH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液复溶后加入标记抗体，室温反应2小时，加入含有10％BSA的0.05MpH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液，室温反应30分钟，洗涤荧光微球，用含有1％BSA，0.1％Tween-20，0.05MpH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液复溶至原体积，定量喷涂于聚酯膜上，避光35-38℃烘干1小时，加入干燥剂封存备用。其中在所述步骤3)中，所述检测区和质控区间隔3mm至8mm，所述第二TG单克隆抗体和所述抗抗体的包被浓度分别为0.5～2mg/ml。本专利技术与现有技术相比具有以下积极效果：(1)本专利技术的人Tg抗原表位肽具有良好的抗原性，用其制备的抗原免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。所述抗体能够高度特异地与样本中的Tg结合。(2)本专利技术将荧光分析技术与快速层析免疫技术相结合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测人甲状腺球蛋白(Tg)从而快速鉴别甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移的荧光免疫层析试纸，该试纸通过双抗体夹心法和荧光免疫层析技术检测待测样品中的人Tg从而判断是否发生了甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移，其中：所述试纸具有底板，并且在该底板上沿使用时的层析方向依次以接触方式设置有：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，该试纸通过双抗体夹心法和荧光免疫层析技术检测人Tg，其中：所述双抗体夹心法采用标记有荧光微球的第一Tg单克隆抗体作为检测抗体，所述第一Tg单克隆抗体利用人Tg抗原表位肽(1)和(2)中的一个作为抗原制备获得；并且所述双抗体夹心法采用第二Tg单克隆抗体作为捕获抗体，所述第二单克隆抗体利用人Tg抗原表位肽(1)和(2)中的另一个作为抗原制备获得；所述人Tg抗原表位肽(1)和(2)分别为：(1)PKRCPRSCEIRNRRLLHGV(SEQ ID NO：2)(2)AERRFQAPEPLNWTGSWDASKPRA(SEQ ID NO：3)。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测人甲状腺球蛋白(Tg)从而快速鉴别甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移的荧光免疫层析试纸，该试纸通过双抗体夹心法和荧光免疫层析技术检测待测样品中的人Tg从而判断是否发生了甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移，其中：所述试纸具有底板，并且在该底板上沿使用时的层析方向依次以接触方式设置有：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，该试纸通过双抗体夹心法和荧光免疫层析技术检测人Tg，其中：所述双抗体夹心法采用标记有荧光微球的第一Tg单克隆抗体作为检测抗体，所述第一Tg单克隆抗体利用人Tg抗原表位肽(1)和(2)中的一个作为抗原制备获得；并且所述双抗体夹心法采用第二Tg单克隆抗体作为捕获抗体，所述第二单克隆抗体利用人Tg抗原表位肽(1)和(2)中的另一个作为抗原制备获得；所述人Tg抗原表位肽(1)和(2)分别为：(1)PKRCPRSCEIRNRRLLHGV(SEQIDNO：2)(2)AERRFQAPEPLNWTGSWDASKPRA(SEQIDNO：3)。2.根据权利要求1所述的荧光免疫层析试纸，其特征在于，所述结合垫设置有所述标记有荧光微球的第一Tg单克隆抗体。3.根据权利要求1或2所述的荧光免疫层析试纸，其特征在于，所述硝酸纤维素膜包括检测带和质控带，所述检测带固定有所述第二Tg单克隆抗体，所述质控带包被有能与所述标记有荧光微球的第一Tg单克隆抗体特异性结合的抗抗体，所述检测带和质控带间隔3mm至8mm。4.根据权利要求1或2所述的荧光免疫层析试纸，其特征在于，其中所述荧光微球上的荧光物质为稀土离子铕，或所述荧光微球的微球材料为聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯的共聚物。5.根据权利要求1或2所述的荧光免疫层析试纸，其特征在于，其中所述抗抗体为羊抗鼠IgG多克隆抗体或兔抗鼠IgG...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹贤，周彬，李文新，施龙顺，包建东，朱国华，高芸，王国瑞，李秀龙，杨克勤，
申请(专利权)人：江苏省原子医学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32