一种推算金腰属植物基因组大小的方法技术

本发明专利技术公开一种推算金腰属植物基因组大小的方法。该方法包括以新鲜金腰属植物为材料、细胞核解离液配置、单细胞悬浮液制备、显微镜镜检、参照样本的选择，最终通过流式细胞仪推算出样品基因组大小的过程。本发明专利技术细胞核解离液配置简单，解离效率高，镜检效果明显，适用于金腰属各种植物的基因组大小的推算。为金腰的后续科学研究提供帮助，为金腰属植物的分类及开发应用研究奠定基础。

A Method for Estimating Genome Size of Cashew Plants

【技术实现步骤摘要】
一种推算金腰属植物基因组大小的方法
本专利技术属于细胞生物学领域，具体涉及一种推算金腰属植物基因组大小的方法。
技术介绍
金腰属植物为多年生小草本，常具鳞茎或者鞭匐枝。单叶，基生叶有互生和对生两种，具柄，无托叶。通常为聚伞花序，周围苞叶；花小型，绿色、黄色、白色或带紫色；托杯内壁通常多少与子房愈合；4萼片，在芽中呈瓦状排列；无花瓣，花盘极不明显或无，或明显(4)8裂，有时其周围具褐色乳头状突起；雄蕊8(10)或4；花丝钻形，花药2室，侧裂，花粉粒微细，具3拟孔沟，并具华美网纹；2心皮通常中下部合生，子房近上位、半下位或近下位，1室，胚珠多数，具2侧膜胎座，花柱2，离生，柱头具斑点。蒴果的2果瓣分为近等大或明显不等大两种；种子较多，卵球形至椭圆球形，有时光滑无毛，有时具微乳头状突起、微柔毛或微瘤突，有时具纵肋，肋上具横纹、乳头状突起或微瘤突等。染色体数目、基因组大小不明确。金腰属植物全球约70种，亚、欧、非、美四洲均有分布，以亚洲温带分布为主。中国目前发现金腰属植物约40-45种(包括变种在内)，广泛分布于云南、西藏、四川、贵州、湖北、湖南、东北等二十多个省份。金腰属植物药用种类较多，《中国植物志》、《中国药植图鉴》、《全国中草药汇编》以及各地中草药典籍均有关于本属药用植物的记载。本属药用植物多用于清热解毒、治疗肝胆病等。其在中国传统医药历史发展中得到广泛应用，藏药中称其为亚吉玛，藏医学者登增彭错著作《晶珠本草》中载有“亚吉玛生于高山石隙，味苦性凉，缓吐泻，治胆疾。”此外金腰属植物也在蒙医学著作《无误蒙药鉴》中也有记载。近年来研究表明金腰属植物普遍含有较高的黄酮类及三萜类化合物具良好抗肿瘤和抗病毒活性，其中从裸茎金腰C.nudicale中分离到的五环三萜对恶性褐色瘤(A375)、4种胃癌(ST-KM,KaTo-III,NKPS,KKLS)和膀胱癌(KK-47)都具较强抑制作用，且该属植物中特有且普遍存在的金腰酮B和金腰酮C(ChrysosplenolB,ChrysosplenolC)都有显著的抗病毒活性。以上生理活性表明金腰属植物值得进一步研究和开发。自从首次的双螺旋结构被解析以来，测序技术已经成为了分子生物学领域的重要手段之一。对于每一个生物体，基因组作为遗传信息的载体能真实的反映该物种进化、遗传等各种信息，从而全面地揭示该物种基因组水平上的多样性和复杂性。因此，要想对一个物种进行全基因组水平上的了解，对该物种的基因组的测定显得十分必要。DNA测序技术经历了三代的发展。以Sanger的双脱氧链终止法和Maxam化学降解法为基础的为第一代测序技术。在这第一代技术当中，最普及的是Sanger的双脱氧链终止法，刚一上市备受欢迎，特点是技术原理简单、精确度高，缺点是操作过程复杂，时间周期较长且成本很高。自2005年以来，第二代测序技术以高通量、低成本、周期短等特点而非常受欢迎，代表的平台有Roche/454，Illumina/Hiseq，ABI/SOLID等，这让科研工作者在短时间内就可获得大量的数据成分可能，并使得数据库的数据呈指数增长，为生物信息研究人员提供丰富的数据资源。在一代和二代技术的改进基础上，以单分子测序技术为特点的第三代测序技术已经诞生，这种技术将具备更高的灵敏度和更长的读长。但是三代测序技术成本较高，对于高等植物的测序而言，在测序前估算植物样本的DNA含量是有效控制成本的重要手段。流式细胞仪(flowcytometer)的诞生标志着在单细胞水平上定性、定量分析及分选检测技能的快速发展，并在血液学、免疫学、肿瘤学、分子生物学和细胞生物学等学科的基础研究及临床检验中得到了广泛应用。但在植物学研究领域中，由于植物组织与细胞结构复杂，使流式细胞仪在植物科学中的应用滞后于其它学科。近30年来，随着流式细胞仪多功能开发、多参数流式分析与分选技术建立、流式样品制备技术的不断更新，流式细胞术在植物科学领域如植物遗传育种、植物染色体分析与文库构建、逆境植物学、植物分类学、植物病理学等各个学科中显示出广阔的应用前景。大多数生物体遗传信息编码的DNA定位于细胞核，DNA含量的检测技术是开发最早、应用最广泛、最基本的流式细胞术之一。流式细胞仪检测DNA含量的原理是利用特殊的荧光染料(PI、DAPI、AO等)与细胞内DNA碱基结合，在一定的压力下染色细胞进入流式细胞仪的流动室经激光照射后发射出荧光，通过滤片可收集到每个细胞相应的荧光强度，再根据染色细胞的荧光强度即可推算出细胞的DNA含量。流式细胞仪要求被检测的植物样本必须是完整的单细胞或细胞核悬液。在制备植物单细胞悬液时会产生大量的碎片，干扰细胞核DNA含量的检测。Hepes解离液的常用染色剂为PI燃料，对流逝细胞仪有较大的伤害，且对植物染色分辨率较差。查阅资料发现目前没有金腰属植物细胞核解离的方法，金腰属植物存在大量次生代谢物，如何很好的去除次生代谢物，寻找最适合金腰属植物的解离液，准确的推算出金腰属植物的基因组大小，是目前急需解决的问题。
技术实现思路
为了解决现有技术中的问题，本专利技术提供了一种简单的、适用的金腰属植物基因组大小的推算。专利技术人通过多次，反复的实验和摸索确定出适合金腰属植物的细胞解离液，从而可以准确的推算出金腰属植物的基因组大小。在一个实施方式中，一种推算金腰属植物基因组大小的方法，具体步骤为：(1).获取叶片：选取新鲜叶片1平方厘米左右；(2).预处理：，加入0.5ml左右预冷的改良Hepes解离液，游离细胞核，所述改良Hepes解离液为10mmol/LMgSO4·7H2O，50mmol/LKCl，5mmol/LHepes(pH8)，10mmol/LDTT，0.25％TritonX-100，0.2mmol/LTris·HCl；(3).细胞核悬浮液制备：使用滤膜将悬浮液过滤至1.5ml的离心管中，加入1/10体积的DAPI溶液，避光染色30分钟；(4).参照样本的选择：选取大豆新鲜叶片组织，与重复步骤(1)-(3)，制备成细胞核悬浮液，备用；(5).镜检观察；(6).上机检测：先检测大豆细胞核悬浮液，再检测金腰属物种细胞核悬浮液；(7).样本基因组大小预测：通过比对参照样本与目标样本的峰值图，推算出金腰的基因组大小。在一个实施方式中，所述金腰属植物为大叶金腰、肾萼金腰或中华金腰。在一个实施方式中，所述滤膜为400目。在一个实施方式中，所述DAPI溶液浓度为：10μg/ml。在一个实施方式中，所述大豆基因组大小为：950M。在一个实施方式中，所述方法的步骤为：(1).获取叶片：选取盆栽里的生长茂盛的金腰植株，取其新鲜叶片1平方厘米左右，然后用蒸馏水清洗干净叶片表面附着的泥土，后续实验操作过程需在冰上进行；(2).预处理：将洗干净的叶片放入预冷的塑料培养皿中，加入0.5ml左右预冷的Hepes解离液，用锋利的刀片一次性快速切碎，整个过程，材料须浸没在解离液里，以便更好的游离细胞核，；(3).细胞核悬浮液制备：使用滤膜将悬浮液过滤至1.5ml的离心管中，加入1/10体积的DAPI溶液，避光染色30分钟，所述滤膜为400目，所述DAPI溶液浓度为：10μg/ml；(4).参照样本的选择：选取大豆新鲜叶片组织，与金腰做相同处理，制备成细胞核悬浮液，备用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种推算金腰属植物基因组大小的方法，其特征在于，所述方法的步骤为：(1).获取叶片：选取新鲜叶片1平方厘米左右；(2).预处理：加入0.5ml左右预冷的改良Hepes解离液，游离细胞核，所述改良Hepes解离液为10mmol/L MgSO4·7H2O，50mmol/L KCl，5mmol/L Hepes(pH 8)，10mmol/L DTT，0.25％Triton X‑100，0.2mmol/L Tris·HCl；(3).细胞核悬浮液制备：使用滤膜将悬浮液过滤至1.5ml的离心管中，加入1/10体积的DAPI溶液，避光染色30分钟；(4).参照样本的选择：选取大豆新鲜叶片组织，与重复步骤(1)‑(3)，制备成细胞核悬浮液，备用；(5).镜检观察；(6).上机检测：先检测大豆细胞核悬浮液，再检测金腰属物种细胞核悬浮液；(7).样本基因组大小预测：通过比对参照样本与目标样本的峰值图，推算出金腰的基因组大小。

【技术特征摘要】
1.一种推算金腰属植物基因组大小的方法，其特征在于，所述方法的步骤为：(1).获取叶片：选取新鲜叶片1平方厘米左右；(2).预处理：加入0.5ml左右预冷的改良Hepes解离液，游离细胞核，所述改良Hepes解离液为10mmol/LMgSO4·7H2O，50mmol/LKCl，5mmol/LHepes(pH8)，10mmol/LDTT，0.25％TritonX-100，0.2mmol/LTris·HCl；(3).细胞核悬浮液制备：使用滤膜将悬浮液过滤至1.5ml的离心管中，加入1/10体积的DAPI溶液，避光染色30分钟；(4).参照样本的选择：选取大豆新鲜叶片组织，与重复步骤(1)-(3)，制备成细胞核悬浮液，备用；(5).镜检观察；(6).上机检测：先检测大豆细胞核悬浮液，再检测金腰属物种细胞核悬浮液；(7).样本基因组大小预测：通过比对参照样本与目标样本的峰值图，推算出金腰的基因组大小。2.权利要求1所述的推算金腰属植物基因组大小的方法，其特征在于，所述金腰属植物为大叶金腰、肾萼金腰或中华金腰。3.权利要求1所述的推算金腰属植物基因组大小的方法，其特征在于，所述滤膜为400目。4.权利要求1所述的推算金腰属植物基因组大小的方法，其特征在于，所述DAPI溶液浓度为：10μg/ml。5.权利要求1所述的推算金腰属植物基因组大小的方法，其特征在于，所述大豆基因组大小为：950M。6.权利要求1所述的推算金腰属植物基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：覃瑞，刘虹，吴智华，廖瑞，董翔，
申请(专利权)人：中南民族大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42