一种基于端粒酶扩增的miRNAs检测方法技术

本发明专利技术涉及一种基于端粒酶扩增的miRNAs检测方法，包括链霉亲和素修饰磁珠连接生物素修饰的探针、探针与靶标miRNAs结合、端粒酶扩增和检测。本发明专利技术设计发夹结构探针，以识别靶标miRNAs后露出的引起序列，诱发端粒酶扩增进一步放大信号，并通过磁分离进行miRNAs可视化检测。分离方法便捷，所用材料部分已商品化，生物安全性高。检测过程不需借助专业仪器，反应仅需水浴锅进行，适应基层医疗检测需求。本发明专利技术成本低廉、检测灵敏、特异性高且可视化。

A Detection Method of MicroRNAs Based on Telomerase Amplification

【技术实现步骤摘要】
一种基于端粒酶扩增的miRNAs检测方法
本专利技术涉及一种基于端粒酶扩增的miRNAs检测方法，一种microRNAs（miRNAs）含量的检测方法，具体涉及一种以前列腺癌标志物miRNAs为靶标，设计与之互补的发夹结构识别探针，与靶标识别后暴露末端端粒酶识别引物。利用端粒酶识别引物并进行核酸扩增，得到富含鸟嘌呤（G）的重复产物，与血晶素结合后进行可视化检测的方法。本专利技术属于分子生物检测领域。
技术介绍
前列腺癌是一种在全球范围内男性高发的生殖系统恶性肿瘤。2017年，美国新报道发病161360例，死亡26730例。伴随生存环境的变迁，前列腺癌在中国呈现爆发式增长，对男性健康的威胁与日俱增。目前临床通常采用前列腺特异抗原（PSA）对潜在前列腺癌患者进行筛查，并采用影像学分析和穿刺活检对患者进行确诊。然而PSA筛查的检测灵敏度和特异性存在较大问题，假阳性率过高，导致部分病人进行非必要的活检和过度治疗，从而承受巨大的痛苦。并且早期前列腺癌治愈率较高，因此寻找新的标志物及检测方法，实现前列腺癌的早期诊断和及时治疗，对延长患者生存期具有重要价值。RNA包含了疾病病理学特征和发展过程中重要的信息，可以作为研究癌症发病机制、识别感染及其耐药性的重要生物标志物。其中，microRNAs（miRNAs）是一类小的高度保守的内源性非编码RNAs，其长度通常在20~25nt，通过与目标mRNA3，端的非编码区互补结合调控靶基因的表达。每一种miRNA可以调控多种靶基因，而每一种mRNA又可以与不同的miRNAs结合，因此60%的编码基因被占据人基因组的1%的miRNAs进行调控。MiRNAs参与调控一系列的细胞功能，如细胞增殖、分化和死亡等。同时miRNAs通过致癌和抑癌的双向功能参与多种实体瘤的细胞通路，因此miRNAs可以作为疾病早期诊断、预后和治疗的极佳的生物标志物。传统的miRNAs检测方法主要有：（1）电化学法：中国专利技术专利：一种检测miRNA的方法，公开号：CN103698375A；（2）荧光定量PCR法：中国专利技术专利：一种快速miRNAs定量PCR检测试剂盒，公开号：CN201381322Y；（3）芯片法：中国专利技术专利：同时检测miRNAs与蛋白标记物的硅纳米线芯片及其检测方法和应用，公开号：CN102980920A；（4）微阵列法：中国专利技术专利：基于外周血游离核苷酸miRNAs超灵敏检测装置的试剂盒及其检测方法，公开号：CN108660216A。上述方法都具有一定局限性，比如检测灵敏度低、特异性不佳、耗时间久、样品需求量较大，检测需借助专业的仪器，操作复杂繁琐，限制了其在临床诊断方面的潜在应用。因此开发一种灵敏、快速的miRNAs检测方法具有较高的研究意义和应用价值。
技术实现思路
针对现有检测的需求，本专利技术目的在于提供一种基于端粒酶扩增的miRNAs检测方法。本专利技术目的通过下述技术方案实现：一种基于端粒酶扩增的miRNAs检测方法，包括链霉亲和素修饰磁珠连接生物素修饰的发夹结构的探针，探针与靶标miRNAs结合、端粒酶扩增和检测，探针包含与靶标miRNAs的互补序列和与端粒酶识别引物序列，发夹结构的探针识别靶标miRNAs后露出的引起序列，诱发端粒酶扩增进一步放大信号，并通过磁分离进行miRNAs可视化检测，包括以下步骤：（1）链霉亲和素修饰磁珠连接生物素修饰的探针：取10μL100μM生物素修饰的探针序列，包括Seq.No.3DNA3、Seq.No.4DNA4、Seq.No.6DNA6、Seq.No.7DNA7、Seq.No.9DNA9、Seq.No.10DNA10、Seq.No.12DNA12、Seq.No.13DNA13、Seq.No.15DNA15、Seq.No.16DNA16中的一种或二种以上，于90℃孵育5min，缓慢降至室温，使探针序列形成发夹结构，记为hairpin-DNA；取100μL链霉亲和素修饰磁珠（SA-beads）置于磁力架上，1min后移除上清液，沉淀采用500μL缓冲液I重悬，所述的缓冲液I为10mMTris-HCl，1mMEDTA，1MNaCl，pH=7.5；10μL100μM的hairpin-DNA与5~20μL100μM的Seq.No.1DNA1以摩尔比0.5:1~2:1的比例混合均匀后，与SA-beads进行充分混合，室温反应30min；将混合液置于磁力架上，磁分离去除未结合DNA，采用10mMPB缓冲液洗涤磁珠3次，沉淀采用100μL10mMPB缓冲液重悬，即可得到磁珠连接的探针，所述PB缓冲液为1MNaCl、20mMMgCl2，pH7.4；（2）探针与miRNAs结合：取10μL步骤（1）合成的磁珠连接的探针采用10mMPB缓冲液稀释10倍，加入0-100nM靶标miRNAs，包括核酸序列表中Seq.No.2RNA2、Seq.No.5RNA5、Seq.No.8RNA8、Seq.No.11RNA11或Seq.No.14RNA14的溶液，混合均匀后于45℃杂交反应30min；将混合液置于磁力架上，磁分离去除上清，采用10mMPBS缓冲液I洗涤三次，去除未捕获的miRNAs，所述的PBS缓冲液I为10mMNa2HPO4、2mMKH2PO4、137mMNaCl、2.7mMKCl，pH值7.4；沉淀采用100μL端粒酶延伸缓冲液（Te缓冲液）重悬，得到包含识别引物的混合液，所述的Te缓冲液为：20mMTris-HCl，1.5mMMgCl2，63mMKCl，0.005%（v/v）Tween-20,1mMEGTA；（3）端粒酶扩增：100μL步骤（2）得到的包含识别引物的混合液中加入20μL端粒酶提取物和1mM的dNTPs，混合均匀后，于30℃反应1hr后，采用磁分离去除上清液，采用10mMPBS缓冲液II洗涤三次，沉淀采用100μLPBS缓冲液II重旋，得到混合液，所述的缓冲液II为10mMNa2HPO4、2mMKH2PO4、137mMNaCl和50mMKCl；端粒酶与识别引物结合后，以自身RNA的模板区为模板，在dNTP存在的条件下，在引物末端添加6个碱基的重复序列（AGGGTT）；（4）检测：1μL20μM的氯化血红素（hemin，或称：血晶素）溶液加入100μL步骤（3）得到的混合液，混合均匀后室温孵育10min后，加入1μL40mM过氧化氢（H2O2）和50μL2mM2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS），混合均匀后，根据靶标浓度的不同，观测溶液颜色变化，采用紫外分光光度计记录405nm处吸光度的变化。所述的探针序列其5’末端修饰生物素，探针从5’端到3’端主要包含茎结合区、靶标miRNAs互补序列和端粒酶识别引物序列，端粒酶序列区域可与茎接合区互补，使探针形成发夹结构。探针在与miRNAs充分结合后，打开探针的茎环结构，露出3，端端粒酶识别引物，再加入端粒酶后，端粒酶与暴露的引物序列结合，在存在dNTP时，可以在引物末端形成重复的富含鸟嘌呤的序列。进一步地，采用磁分离去除多余的酶与dNTP，加入血晶素，形成具有过氧化物酶活性的复合物，催化2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）显色，即可对miRNAs的含量进本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于端粒酶扩增的miRNAs检测方法，其特征在于，包括链霉亲和素修饰磁珠连接生物素修饰的发夹结构的探针，探针与靶标miRNAs结合、端粒酶扩增和检测，探针包含与靶标miRNAs的互补序列和与端粒酶识别引物序列，发夹结构的探针识别靶标miRNAs后露出的引起序列，诱发端粒酶扩增进一步放大信号，并通过磁分离进行miRNAs可视化检测，包括以下步骤：1、包括以下步骤：（1）链霉亲和素修饰磁珠连接生物素修饰的探针：取10 μL 100 μM生物素修饰的探针序列，包括Seq.No.3 DNA3、Seq.No.4 DNA4、Seq.No.6 DNA 6、Seq.No.7 DNA 7、Seq.No.9 DNA 9、Seq.No.10 DNA 10、Seq.No.12 DNA 12、Seq.No.13 DNA 13、Seq.No.15 DNA 15、Seq.No.16 DNA 16中的一种或二种以上，于90℃孵育5 min，缓慢降至室温，使探针序列形成发夹结构，记为hairpin‑DNA；取100 μL链霉亲和素修饰磁珠（SA‑beads）置于磁力架上，1 min后移除上清液，沉淀采用500 μL缓冲液I重悬，所述的缓冲液I为10 mM Tris‑HCl，1 mM EDTA，1M Na Cl，pH=7.5；10 μL 100 μM 的hairpin‑DNA与 5~20 μL 100 μM 的Seq.No.1 DNA 1以摩尔比0.5:1~2:1的比例混合均匀后，与SA‑beads进行充分混合，室温反应30 min；将混合液置于磁力架上，磁分离去除未结合DNA，采用10 mM PB缓冲液洗涤磁珠3次，沉淀采用100 μL 10 mM PB缓冲液重悬，即可得到磁珠连接的探针，所述PB缓冲液为1M Na Cl、20mM Mg Cl2，pH 7.4；（2）探针与miRNAs结合：取10 μL步骤（1）合成的磁珠连接的探针采用10 mM PB缓冲液稀释10倍，加入0‑100 nM 靶标miRNAs，包括Seq.No.2 RNA 2、Seq.No.5 RNA 5、Seq.No.8 RNA 8、Seq.No.11 RNA 11或Seq.No.14 RNA 14的溶液，混合均匀后于45℃杂交反应30 min；将混合液置于磁力架上，磁分离去除上清，采用10 mM PBS缓冲液I洗涤三次，去除未捕获的miRNAs，所述的PBS缓冲液I为10 mM Na2 HPO4、2 mM K H2PO4、137 mM Na Cl、2.7 mM K Cl，pH 7.4；沉淀采用100 μL端粒酶延伸缓冲液（Te缓冲液）重悬，得到混合液，所述的Te缓冲液为：20 mM Tris‑H Cl，1.5 mM Mg Cl2，63 mM K Cl，0.005%（...

【技术特征摘要】
1.一种基于端粒酶扩增的miRNAs检测方法，其特征在于，包括链霉亲和素修饰磁珠连接生物素修饰的发夹结构的探针，探针与靶标miRNAs结合、端粒酶扩增和检测，探针包含与靶标miRNAs的互补序列和与端粒酶识别引物序列，发夹结构的探针识别靶标miRNAs后露出的引起序列，诱发端粒酶扩增进一步放大信号，并通过磁分离进行miRNAs可视化检测，包括以下步骤：1、包括以下步骤：（1）链霉亲和素修饰磁珠连接生物素修饰的探针：取10μL100μM生物素修饰的探针序列，包括Seq.No.3DNA3、Seq.No.4DNA4、Seq.No.6DNA6、Seq.No.7DNA7、Seq.No.9DNA9、Seq.No.10DNA10、Seq.No.12DNA12、Seq.No.13DNA13、Seq.No.15DNA15、Seq.No.16DNA16中的一种或二种以上，于90℃孵育5min，缓慢降至室温，使探针序列形成发夹结构，记为hairpin-DNA；取100μL链霉亲和素修饰磁珠（SA-beads）置于磁力架上，1min后移除上清液，沉淀采用500μL缓冲液I重悬，所述的缓冲液I为10mMTris-HCl，1mMEDTA，1MNaCl，pH=7.5；10μL100μM的hairpin-DNA与5~20μL100μM的Seq.No.1DNA1以摩尔比0.5:1~2:1的比例混合均匀后，与SA-beads进行充分混合，室温反应30min；将混合液置于磁力架上，磁分离去除未结合DNA，采用10mMPB缓冲液洗涤磁珠3次，沉淀采用100μL10mMPB缓冲液重悬，即可得到磁珠连接的探针，所述PB缓冲液为1MNaCl、20mMMgCl2，pH7.4；（2）探针与miRNAs结合：取10μL步骤（1）合成的磁珠连接的探针采用10mMPB缓冲液稀释10倍，加入0-100nM靶标miRNAs，包括Seq.No.2RNA2、Seq.No.5RNA5、Seq.No.8RNA8、Seq.No.11RNA11或Seq.No.14RNA14的溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐艳，陈玮嘉，张兆坤，朱君，王萍，
申请(专利权)人：上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31