一种利用微液滴催化芦丁产异槲皮苷的酶催化反应体系。应用流动聚焦型芯片，以重组菌株E.coli BL21(DE3)‑pET21a‑rhaB1发酵获得的粗酶液和含底物的缓冲液按相比1:1(v/v)混合为分散相，硅油为连续相，调控分散相和连续相的压力范围为25～200mbar，制备微液滴。配制芦丁溶液和α‑L‑鼠李糖苷酶的粗酶液，应用微液滴酶制备活性产物异槲皮苷。将含微液滴酶反应体系的导管置于25～60℃，0.1～5h后取出，收集导管内备用。本发明专利技术采用微流控芯片可制备特定的液滴，将其作为独立的微反应器，具有体积小、比表面积大、环境封闭且稳定、药品用量少、无交叉污染等优势，并能提高酶促合成效率。
An Enzymatic Reaction System for Rutin to Isoquercitrin Catalyzed by Microdroplets
【技术实现步骤摘要】
一种利用微液滴催化芦丁产异槲皮苷的酶催化反应体系
本专利技术属于生物化工领域，具体涉及一种利用微液滴催化芦丁产异槲皮苷的酶催化反应体系。
技术介绍
微液滴是指两种互不相融的液体所形成直径在微米或纳米级的液滴。它利用流体剪切力和表面张力之间的相互作用将连续的液体分离成微型液滴(微纳电子技术,2016,53:108-113.)。微液滴技术具有许多优点，微液滴可作为一个小体积的反应体系，将反应物料包封在微滴内，可显著加快混合的速率和物质之间的反应；反应时间可控，液滴尺寸也可精确控制，同时微液滴芯片可重复使用(ChemicalEngineeringScience,2016,169:273-283)。此外，液滴反应器提供的匀质效应可大大提高反应效率，如微液滴可将常规反应器中仅60％的水解反应效率提高至100％(ChemPlusChem,2016,81:629-636)，显示了微液滴系统应用于酶催化反应的巨大优势。芦丁(Rutin)，能够为α-L-鼠李糖苷酶催化转化为异槲皮苷和L-鼠李糖(现代食品科技,2015(1):107-114.)。异槲皮苷属黄酮类化合物，具有抗氧化、抗肿瘤、抗抑郁、降压、降脂等众多药理作用(海峡药学,2015:223-225)，临床上用于治疗心肌缺血、缺氧等，国际上将其加工成食品添加剂和辅助药物，可作为药物有效成分而直接用于药物生产，比前体物芦丁(含量5～20％)具有更强的抗氧化性和抗癌活性(Biotech,2016,6:3)，更是合成新型食品着色剂EMIQ(EnzymaticallyModifiedIsoquercitrin)的中间体(NeurochemistryInternational,2010,57:713-721)，作用效果显著，应用面广。自然界中的鼠李糖苷酶有α-L-鼠李糖苷酶和β-L-鼠李糖苷酶两类(中国酿造,2010,29:11-15)。截至目前，由于条件限制，α-L-鼠李糖苷酶尚未进行规模化生产，导致纯酶价格偏高，酶的应用发展受到制约。HFM-rha78是从健康人体粪便宏基因组DNA中获得的新型细菌源α-L-鼠李糖苷酶基因，在37℃下随酶浓度增加芦丁转化率增大，作用10h时芦丁转化率为41.8％(中国生物化学与分子生物学报,2018,34(12))。重组菌株表达的α-L-鼠李糖苷酶比野生菌株更有利于芦丁催化为异槲皮苷的定向反应(江苏科技大学,2017)。酶法催化合成异槲皮苷存在一大问题，芦丁及其水解产物异槲皮苷和槲皮素均具有强抗氧化性，受热不稳定，长时间会导致氧化或其他反应物生成。因此，一个封闭体系用于α-L-鼠李糖苷酶催化芦丁生成异槲皮苷，有望解决产物、底物不稳定、容易被氧化等技术瓶颈。
技术实现思路
本专利技术针对水解芦丁的生物催化剂α-L-鼠李糖苷酶来源稀少且价格昂贵，造成了生产异槲皮苷的成本过高的问题，提供了一种利用微液滴催化芦丁产异槲皮苷的酶催化反应体系，该酶催化反应体系反应条件温和、底物选择性强、环境友好，可处理仅有少量液体的全新技术，提高胞内酶与底物接触几率。一种利用微液滴催化芦丁产异槲皮苷的酶催化反应体系，所述酶催化反应体系通过以下步骤构建：步骤1，构建重组菌株E.coliBL21(DE3)-pET21a-rhaB1，培养并诱导表达，诱导表达结束后，离心使得细胞破碎，取上清液，即粗酶液备用；步骤2，用pH4.0～8.0的PBS缓冲液配制浓度为0.01～1g/L的芦丁溶液，再取浓度为30.00U/mg的粗酶液，等体积混合得微液滴形成所需水相即分散相，粘度为5CS的聚二甲基硅氧烷甲基硅油作为微液滴形成所需油相即连续相；步骤3，应用微液滴芯片，选取分散相压力为25～200mbar，连续相压力为25～200mbar，操作微液滴形成装置形成微液滴，待液滴稳定、均一后，收集于密封PTFE中进行酶催化反应，待反应结束后，用恒流泵冲洗出来产物异槲皮苷，并进行含量检测。作为改进的是，所述微液滴芯片的选型为流动聚焦型芯片。进一步改进的是，所述流动聚焦型芯片的长22.5mm，宽15.0mm，厚度4.0mm，两相交融处，两相微通道内径均为250μm，交融处后部分内径400μm。作为改进的是，分散相压力为125mbar，连续相压力为150mbar，调控制备液滴，稳定后收集于密封PTFE导管。作为改进的是，步骤3中酶催化反应的反应温度为25～60℃；反应pH为4.0～8.0；反应时间为0.1～5h。有益效果：本专利技术采用微液滴技术，运用流动聚焦型芯片，其反应条件温和、底物选择性强、环境友好，可处理仅有少量液体的全新技术，提高胞内酶与底物接触几率。相对于传统的酶催化反应的时空效率低、酶用量大且过程难以放大，造成成本高，产物率低的现象，采用微液滴技术，有助于解决上述问题，从而扩大微液滴酶催化反应体系的应用范围。并且利用PTFE导管收集时，增加导管长度收集液滴，对酶催化反应结果影响不显著，故可将微液滴酶催化反应体系线性放大应用于平台制备活性产物。重组菌株E.coliBL21(DE3)-pET21a-rhaB1表达的α-L-鼠李糖苷酶比野生菌株更有利于芦丁催化为异槲皮苷的定向反应。利用该微液滴酶催化反应体系在生物转化芦丁上的应用，降低了成本，提高了产物得率，并且具有良好的产业化前景。附图说明图1为异槲皮苷标准品的HPLC色谱图；图2为经微液滴酶催化后体系中的芦丁、异槲皮苷量的HPLC色谱图，其中，1-异槲皮苷，2-芦丁。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。本专利技术实施例中制备微液滴酶催化反应体系方法为：使用成功构建的微液滴形成系统，油相采用稳定性好、无毒性的粘度为5CS的聚二甲基硅氧烷甲基硅油，水相为芦丁与α-L-鼠李糖苷酶混合液，通过操作微液滴形成系统调节连续相和分散相压力值，使体系所形成的液滴稳定性好、形成频率高、大小尺寸适当，用PTFE导管收集液滴，既得微液滴。本专利技术实施例中使用检测芦丁和异槲皮苷定性定量的测定方法为高效液相色谱法，条件为：H&EPumpP3000A恒流泵，UV-VIS检测器，色谱柱型号AlltimaC18，长度为25mm，内径为5μm，采用HPLC-UV分离和测定芦丁和异槲皮苷，柱温维持在30℃。流动相为乙腈：(0.02％)磷酸(体积比20：80)，流速1.0ml·min-1，检测波长360nm。进样量为20μL。进样前，样品均通过0.45μm过滤器过滤。其中，芦丁转化率和异槲皮苷得率计算方法为:实施例1重组菌株E.coliBL21(DE3)-pET21a-rhaB1，采用PCR方法从大象粪便中获得目的基因rhaB1(大小为3081bp)。使用的引物为：上游引物序列：5’-CGGGTCGACAGATGTTCGGAAAGG-3’(下划线为SalI酶切位点)，下游引物序列：5’-CCGAAGCTTATAGCTGAAGGTGTAATG-3’(下划线为HindIII酶切位点)。经SalI和HindIII双酶切的PCR产物rhaB1和质粒pET21a，然后用T4本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种利用微液滴催化芦丁产异槲皮苷的酶催化反应体系，其特征在于，所述酶催化反应体系通过以下步骤构建：步骤1，构建重组菌株E.coli BL21(DE3)‑pET21a‑rhaB1，培养并诱导表达，诱导表达结束后，离心使得细胞破碎，取上清液，即粗酶液备用；步骤2，用pH4.0～8.0的PBS缓冲液配制浓度为0.01～1g/L的芦丁溶液，再取浓度为30.00U/mg的粗酶液，等体积混合得微液滴形成所需水相即分散相，粘度为5 CS的聚二甲基硅氧烷甲基硅油作为微液滴形成所需油相即连续相；步骤3，应用微液滴芯片，选取分散相压力为25～200mbar，连续相压力为25～200mbar，操作微液滴形成装置形成微液滴，待液滴稳定、均一后，收集于密封PTFE中进行酶催化反应，待反应结束后，用恒流泵冲洗出来产物异槲皮苷，并进行含量检测。
【技术特征摘要】
1.一种利用微液滴催化芦丁产异槲皮苷的酶催化反应体系，其特征在于，所述酶催化反应体系通过以下步骤构建：步骤1，构建重组菌株E.coliBL21(DE3)-pET21a-rhaB1，培养并诱导表达，诱导表达结束后，离心使得细胞破碎，取上清液，即粗酶液备用；步骤2，用pH4.0～8.0的PBS缓冲液配制浓度为0.01～1g/L的芦丁溶液，再取浓度为30.00U/mg的粗酶液，等体积混合得微液滴形成所需水相即分散相，粘度为5CS的聚二甲基硅氧烷甲基硅油作为微液滴形成所需油相即连续相；步骤3，应用微液滴芯片，选取分散相压力为25～200mbar，连续相压力为25～200mbar，操作微液滴形成装置形成微液滴，待液滴稳定、均一后，收集于密封PTFE中进行酶催化反应，待反应结束后，用恒流泵冲洗出来产物异槲皮苷，并进行...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭强民，汪波，张凡，黄代杰，叶王胜，王俊，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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