一种含有自体真皮成纤维细胞透明质酸凝胶剂的构建方法技术

本发明专利技术提供一种含有自体真皮成纤维细胞透明质酸凝胶剂的构建方法，包括将体外扩增的真皮成纤维细胞与凝胶装载进入特殊药用软膏管，使用时凝胶与活细胞将同时敷在患处，凝胶包裹活细胞，延长制剂中的细胞在体外的活性时间。本发明专利技术延长活细胞存活时间，真皮成纤维细胞活细胞作为主要药效成分，该细胞在患处皮肤缺损时期，覆盖患处，分泌I型胶原蛋白，促进患处组织真皮细胞和表皮细胞的增殖，促进患处愈合，用于烧伤创伤、大面积植皮、及其他急需大面积皮肤缺损的临床需求，具有低排异、可持续供应等优点。

A method for constructing hyaluronic acid gel containing autologous dermal fibroblasts

【技术实现步骤摘要】
一种含有自体真皮成纤维细胞透明质酸凝胶剂的构建方法
本专利技术主要涉及自体细胞体外生产
，透明质酸凝胶制剂制造领域，凝胶软膏管包材制造领域,尤其涉及一种含有自体真皮成纤维细胞透明质酸凝胶剂的构建方法。
技术介绍
自体细胞的体外生产技术目前已经十分成熟。成人自体真皮的成纤维细胞体外增殖技术，已经达到了产业化要求，在国外已经有该产品注射剂上市，国内也出现类似产品。现在成人真皮成纤维细胞的规模化生产朝向高效、高纯度、高活性的方向发展；产品用途可直接制备注射剂，也可以作为其他制剂的主要原料成分。活细胞在不能使用注射剂的临床治疗中，需要依托细胞固化技术。现在已有多项技术，将活细胞固定或构建在片状凝胶、生物膜或化工合成膜、新材料支架等。在用于皮肤科或皮肤缺损治疗中，临床更倾向于片状敷料或凝胶敷料制剂。由于活细胞容易失活的特点，目前上市的成品制剂，还受到产品保存条件严苛、货架期短等特殊要求的制约。
技术实现思路
本专利技术提供一种含有自体真皮成纤维细胞透明质酸凝胶剂的构建方法，针对现有技术的上述缺陷，提供一种含有自体真皮成纤维细胞透明质酸凝胶剂的构建方法，包括以下步骤：第一步：活细胞原料的提取：S1：自体组织采集：对细胞使用人实施外科手术，采集颈后厚皮组织，面积1～2mm2；S2：自体细胞体外生产纯化：厚皮组织分离出真皮部分，放入培养基增殖，成纤维细胞逐渐从组织中脱离到培养容器中，在容器底部贴壁生长；此时培养基成分中，血清成分为FBS12～15％，培养基中使用非必须氨基酸1～2％，使用L谷氨酰胺1～2％，使用培养基中不使用抗生素、抗菌剂；纯化：至生产开始的第10天至12天，通过显微操作，分离到BayreutherFI表型的真皮成纤维细胞克隆，细胞接受离心力为380～420g；重新接种：消化酶为胰蛋白酶，浓度为0.25mg/ml，作用时间为2～3分钟，温度是37℃；消化酶稀释分散的作用，BayreutherFI表型的真皮成纤维细胞，全部漂浮，按20-25万个/cm2密度重新接种。反复培养-消化，得到细胞原料；此时培养基成分中，血清成分为FBS5～7％，，生产周期全程，培养基中使用非必须氨基酸1～2％，使用L谷氨酰胺1～2％，使用培养基中不使用抗生素、抗菌剂；S3：细胞质检与放行：细胞质检在生产中期进行，约生产开始后第14天；此时，细胞已经经过纯化，经过第一轮稀释和培养面积的扩增，质检项目如下表1所示；表1过程质检与放行检验项目表表2细胞原料的放行标准如下表：S4：细胞体外储存与使用：S4.1：存储：细胞原料通过离心法，将细胞介质置换成含有二甲基亚砜的细胞冻存液，进行低温分装后，通过程序降温的方法，将细胞原料进行冷冻，冷冻后的细胞原料将长期储存在液氮蒸汽中，离心力380～420g；S4.2：使用：细胞原料直接进入下一步制剂生产，通过离心重悬的方式，将细胞介质置换成其他溶液，制备成活细胞皮内注射液；第二步：制作预装透明质酸凝胶软膏管：S5：制造软膏管包材：软膏管为双层套管，分体制造；S6：制造透明质酸稀凝胶：S6.1：凝胶生产：稀凝胶采用原料药级微生物发酵工艺生产的透明质酸钠，经过溶液重溶方法，凝胶达到0.2～0.5mg/ml浓度，原料透明质酸凝胶和定量的细胞介质溶液混合搅拌，形成稀凝胶，备用于灌装工艺；S6.2：稀凝胶质检放行：稀凝胶的质量要求既要符合制剂学要求，也要符合细胞介质要求，稀凝胶质检放行标准如下表3所示；表3稀凝胶质检放行标准S7：凝胶罐装：通过软膏剂灌装设备，灌装进入软膏管夹层内，预灌装软膏管密封并保持无菌状态，在2℃～8℃冷库中储存备有；第三步：活细胞原料装载入预装稀凝胶软膏管中形成成品；第四步：产品储存。优选的，在所述S2步骤中，细胞原代培养时期，BayreutherFI表型细胞的克隆与其他表型的克隆混合生长，此时在显微条件下对其他表型的细胞克隆进行去除，以保证所获得的细胞克隆均为FI表型，保证后期产品的纯度。优选的，在所述S4.2步骤中，溶液作用为维持活细胞在体外生存，其简要配方为：注射用水、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、醋酸钠、枸橼酸钠。优选的，在所述S4.2步骤中，活细胞浓度需符合临床需要，又保证不因浓度过大而造成结团，浓度范围2～5×106个细胞/ml。优选的，在所述S6.1步骤中，原料药透明质酸钠与溶液重新调制，调整浓度、PH、渗透压，以保证凝胶剂可以符合活细胞体外生存的条件。此时溶液成分与S4.2相同。优选的，在所述S6.2步骤中，稀凝胶放行质检包括无菌检验、病毒检验、热源检验、支原体检验、纯度检验、浓度检验；以及渗透压检验、PH检验。优选的，在所述S6.2步骤中，稀凝胶浓度范围：0.2～0.5g/mL；PH范围7.2～7.4；渗透压范围：280～360mOsmol/kg。优选的，在所述第三步中，备用的活细胞溶液，装入灌装针内，灌装针直接深入软膏管的内层管管颈装载活细胞，装载后旋紧扭盖。优选的，由于成纤维细胞直径制约，灌装针孔内径大于0.5mm，速度平缓。优选的，在所述第四步中，产品含有活细胞，低温储存期不超过3天，温度2～8℃。优选的，在所述S5步骤中，软膏管包材采用I类药包材低密度聚乙烯材料并旋盖，其中内层管内胆和颈管一次吹塑成型，外层管采用分体塑性再合并的方法，以纵轴分割为2半，每一半包括管身和管颈，管身与内管部分相连，用固定夹层内外管质检的距离，2半管体将融合为软膏管的外层。本专利技术的有益效果：(1)自体真皮成纤维细胞活细胞，装载进入特殊的双层凝胶制剂的包材中，造成“夹芯凝胶”剂，活细胞为“芯”，凝胶为“夹层”，挤压制剂包材管，夹心凝胶将包裹活细胞敷在患处；(2)活细胞在患者皮肤表层时的存活时间很短，但在凝胶的维持下，活细胞存活时间将延长；(3)该细胞是本制剂的主要药效成分，该细胞在患处皮肤缺损时期，覆盖患处，分泌I型胶原蛋白，促进患处组织真皮细胞和表皮细胞的增殖，促进患处愈合；(4)用于烧伤创伤、大面积植皮、及其他急需大面积皮肤缺损的临床需求，具有低排异、可持续供应等优点，有广泛应用前景。附图说明图1为本专利技术中关于自体真皮成纤维细胞在体外培养的形态；图2为本专利技术的制剂剖面结构图；图3为本专利技术的工艺流程图；图中，1、透明质酸凝胶；2、自体成纤维细胞活细胞；3、螺旋管盖。具体实施方式如图1-3所示可知，本专利技术包括有以下步骤：第一步：活细胞原料的提取：S1：自体组织采集：在使用者后颈，用外科皮肤打孔器取数个直径1mm，深4mm的组织。在无菌环境下进行组织分离，选取真皮组织；真皮组织切割后，放入细胞培养基中培养1-3天，3天后，真皮成纤维细胞游离出组织，开始在培养容器中增殖；培养基成分：83％DMEM高糖+15％FBS+1％NEAA+1％谷氨酰胺；S2：自体细胞体外生产纯化：第7天，在显微镜下，用无菌细胞铲，将BayreutherFI表型细胞以外的细胞全部刮掉，用无菌生理盐水反复清洗培养容器，保证剩余细胞表型纯化；高纯度的F1细胞大量克隆增殖，培养3-4天，细胞汇合率达到95％时，用细胞消化酶对细胞进行消化分散，更换更大的培养容器。消化条件：37℃孵育2.5分钟，每次消化后接种密度为20万个/cm2；培养基成分：88％DMEM高糖+10％FBS+1％NEAA+1％谷氨酰胺；消化液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含有自体真皮成纤维细胞透明质酸凝胶剂的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步：活细胞原料的提取：S1：自体组织采集：对细胞使用人实施外科手术，采集颈后厚皮组织；S2：自体细胞体外生产纯化：厚皮组织分离出真皮部分，放入培养基增殖，成纤维细胞逐渐从组织中脱离到培养容器中，在容器底部贴壁生长；生产第10～12天，通过显微操作，去除其他表型真皮成纤维细胞，获得单一Bayreuther FI表型的细胞；使用细胞培养基培养细胞，细胞增殖，使用细胞消化酶对真皮成纤维细胞进行分散，收集Bayreuther FI表型细胞的大量克隆，生成细胞原料；S3：细胞质检与放行：检测合格的细胞原料方可放行，进行储存，或进入下一生产工艺操作；S4：细胞体外储存与使用：S4.1：存储：细胞原料通过离心法，将细胞介质置换成含有二甲基亚砜的细胞冻存液，进行低温分装后，通过程序降温的方法，将细胞原料进行冷冻，冷冻后的细胞原料将长期储存在液氮蒸汽中；S4.2：使用：细胞原料直接进入下一步制剂生产，通过重新离心的方式，将细胞介质置换成其他溶液，制备成活细胞皮内注射液；也可以置换成生理盐水溶液，制成中间产品；第二步：制作预装透明质酸凝胶软膏管：S5：制造软膏管包材：软膏管为双层套管，分体制造；S6：制造透明质酸稀凝胶：S6.1：凝胶生产：稀凝胶采用原料药级微生物发酵工艺生产的透明质酸钠，经过溶液重溶方法制作稀凝胶，原料透明质酸凝胶和定量的细胞介质溶液混合搅拌，稀凝胶达到0.2～0.5mg/ml浓度，备用于灌装工艺；S6.2：稀凝胶质检放行：稀凝胶的质量要求同时符合制剂学要求和细胞介质要求；S7：凝胶罐装：通过软膏剂灌装设备，灌装进入软膏管夹层内，预灌装软膏管密封并保持无菌状态，在2℃～8℃冷库中储存备用；第三步：活细胞原料装载入预装稀凝胶软膏管中形成成品；第四步：产品储存。...

【技术特征摘要】
1.一种含有自体真皮成纤维细胞透明质酸凝胶剂的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步：活细胞原料的提取：S1：自体组织采集：对细胞使用人实施外科手术，采集颈后厚皮组织；S2：自体细胞体外生产纯化：厚皮组织分离出真皮部分，放入培养基增殖，成纤维细胞逐渐从组织中脱离到培养容器中，在容器底部贴壁生长；生产第10～12天，通过显微操作，去除其他表型真皮成纤维细胞，获得单一BayreutherFI表型的细胞；使用细胞培养基培养细胞，细胞增殖，使用细胞消化酶对真皮成纤维细胞进行分散，收集BayreutherFI表型细胞的大量克隆，生成细胞原料；S3：细胞质检与放行：检测合格的细胞原料方可放行，进行储存，或进入下一生产工艺操作；S4：细胞体外储存与使用：S4.1：存储：细胞原料通过离心法，将细胞介质置换成含有二甲基亚砜的细胞冻存液，进行低温分装后，通过程序降温的方法，将细胞原料进行冷冻，冷冻后的细胞原料将长期储存在液氮蒸汽中；S4.2：使用：细胞原料直接进入下一步制剂生产，通过重新离心的方式，将细胞介质置换成其他溶液，制备成活细胞皮内注射液；也可以置换成生理盐水溶液，制成中间产品；第二步：制作预装透明质酸凝胶软膏管：S5：制造软膏管包材：软膏管为双层套管，分体制造；S6：制造透明质酸稀凝胶：S6.1：凝胶生产：稀凝胶采用原料药级微生物发酵工艺生产的透明质酸钠，经过溶液重溶方法制作稀凝胶，原料透明质酸凝胶和定量的细胞介质溶液混合搅拌，稀凝胶达到0.2～0.5mg/ml浓度，备用于灌装工艺；S6.2：稀凝胶质检放行：稀凝胶的质量要求同时符合制剂学要求和细胞介质要求；S7：凝胶罐装：通过软膏剂灌装设备，灌装进入软膏管夹层内，预灌装软膏管密封并保持无菌状态，在2℃～8℃冷库中储存备用；第三步：活细胞原料装载入预装稀凝胶软膏管中形成成品；第四步：产品储存。2.根据权利要求1所述的含有自体真皮成纤维细胞透明质酸凝胶剂的构建方法，其特征在于：在所述S2步骤中，生产开始后的第10～12天，显微视野下，对细胞进行操作，除去非BayreutherFI表型的细胞。3.根据权利要求1所述的含有自体真皮成纤维细胞透明质酸凝胶剂的构建方法，其特征在于：在所述S2步骤中，生产开始后培养基成分中，血清成分为12～15％FBS，在生产开始后的第14天，即首次消化后接种时，培养基成分中，血清成分为5～7％FBS，生产周期全程，培养基中使用非必须氨基酸浓度为1～2％，使用L-谷氨酰胺浓度为1～2％，使用培养基中不使用抗生素、抗菌剂。4.根据权利要求1所述的含有自体真皮成纤维细胞透明质酸凝胶剂的构建方法，其特征在于：在所述S2步骤中，消化酶为胰蛋白酶，浓度为0.25m...

【专利技术属性】
技术研发人员：方攀峰，陈爽，王志刚，王云娟，冷晓燕，
申请(专利权)人：江苏艾尔康生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32