一种寡氧单胞固氮菌株系SI-NJAU-1及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种寡氧单胞固氮菌株系SI‑NJAU‑1及其应用。SI‑NJAU‑1于2019年4月28号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC No：17643。本发明专利技术所述的寡养单胞菌株系通过蛭石回接试验证明其具有高效促生作用，接种该菌株能够加快菊芋的生长速度，可成为更为优质环保的生物肥料。

SI-NJAU-1, an Oligoxic Monocyte Nitrogen Fixation Strain and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种寡氧单胞固氮菌株系SI-NJAU-1及其应用
本专利技术涉及一种中华根瘤固氮菌株系SI-NJAU-1(Stenotrophomonasindicatrix)及其应用。
技术介绍
空气中大约有80％的成分为氮气，仅能够通过具有固氮能力的微生物转化为氨才能被植物利用，这种仅次于光合作用的复杂生物反应系统被人们称为生物固氮(BiologicalNitrogenFixation，BNF)。生物固氮作用是固氮微生物的一种特殊生理功能，根据固氮微生物与高等植物以及其他生物的关系，可以分为两个类型，即自生固氮微生物和共生固氮微生物，相应地生物固氮作用就分为自生固氮作用和共生固氮作用。内生菌与宿主植物的和谐共生关系，是长期进化的结果。植物内生菌在植物体内，与宿主相互协调适应，长期共存，形成稳定的无害的寄生关系或者是互利的共生关系。一方面，植物体为内生微生物提供了充足的养分以及适宜的生长环境，并保护其免受外界环境的胁迫。另一方面，植物内生菌具有固氮作用、解磷效应，能够代谢产生生长激素以及铁载体等，促进植物生长，提高植物的抗病抗逆性，还能够通过各自机制防治植物的病害。内生固氮细菌能在植物根、茎、叶等各种组织内发挥固氮作用，相对于土壤自生固氮菌具有更明显的优势。内生固氮细菌最早是从禾本科植物以及草本科植物中分离发现的，近年来，又陆续从棕榈树、香蕉、菠萝、咖啡树以及油橄榄树等木本科植物中发现。目前，内生固氮细菌被认为广泛的存在于高等植物中，通过联合固氮的方式与植物构成密切的生态关系，为人们研究生物固氮开辟了一条新的途径，为减少化学氮肥的使用，促进农业的可持续生产具有重要意义。菊芋(Helianthustuberosus.L)最早起源于北美，于17世纪被引入欧亚大陆，而在20世纪早期已经成为了一种较为常见的农作物(Seileretal,2006)。菊芋是一种适应性特别广的植物，生存能力特别强，能够在盐碱地和海岸滩涂这些盐浓度较高，绝大部分植物所不能生长的地方进行大范围种植(Longetal,2010；隆小华等，2005)。菊芋发达的根系使得它伸展的区域范围更广，并且即使是在风沙危害较大的沙地不采取任何的措施下种植菊芋，在45天干旱无雨的恶劣条件下它依然能够正常的生长(孔涛等，2009)。除了能够抵抗盐胁迫、抗风沙外，菊芋对高温环境也具有较好的适应性，是一种繁殖能力特别强的植物。这些特征使得它被引入我国之后，被广泛地种植于一些较为贫瘠的地区。其较好的耐盐性，也让它成为了可供选择的具有较好开发前景的盐土植物之一，在江苏沿海滩涂盐碱地可以进行大面积改良。而菊芋的种植势必会使用一定量的化学肥料，尤其是氮肥。因此，找到一种生物肥料来代替氮肥的施用是非常具有意义的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对生物肥料问题，提供一种寡氧单胞固氮菌株系SI-NJAU-1，该菌株是一种新株系，具有高效的固氮特点。另一个目的是提供上述的寡氧单胞固氮菌株系SI-NJAU-1在菊芋中固氮的应用。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现：本专利技术公开的寡氧单胞固氮菌株系SI-NJAU-1于2019年4月28号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCCNo：17643。一、寡氧单胞固氮菌株系SI-NJAU-1的分离1)取新鲜菊芋块茎，用清水冲洗干净，并用滤纸吸干表面水分；2)在用70％的酒精浸泡30-60s，再用2％的NaClO溶液处理5min，最后用超纯无菌水冲洗4-5次。并将最后一次冲洗过的无菌水进行涂布，检测消毒是否彻底。3)消毒后的无菌菊芋块茎用无菌的研钵研磨成浆，静置一段时间后，吸取上清液100μl于100mlJNFB液体培养基中，封口，30℃，每min130转摇床培养，3d后提取上清液转入新的培养基继续培养，共转接三次。4)吸取第三次菌液，梯度稀释10-3-10-5后，分别取100μL涂布于JNFB培养基上，30℃培养3-4d。挑取单菌落在JNFB培养基上划线，JNFB培养基的配方如表1所示，倒置后在30℃下黑暗培养。表1JNFB培养基配方(/L)注：A液：0.5％的溴百里香酚蓝溶液(溶于0.2mol/LKOH)B液：维生素溶液(维生素H0.1mg/ml,吡哆醇0.2mg/ml)C液：微量元素溶液(Na2MoO4·2H2O1g/L,MnSO4·H2O1.175g/L,H3BO31.4g/L,CuSO4·5H2O0.04g/L,ZnSO4·7H2O0.12g/L)D液：Fe-EDTA0.557％5)待长出菌体后，根据菌落形态和培养基的颜色变化判断菌种。二、寡氧单胞固氮菌株系SI-NJAU-1的性质1)形态特征本菌株在菌落形态上，均为慢生型，菌落是光滑的，圆形较小、发亮半透明、白色和淡黄色。在JNFB平板上生长3～5天后的直径为0.1～0.5mm。2)培养特性该菌的最适生长条件为：pH＝5.8，温度30℃，转速130r/min。3)生理特性细胞呈革兰氏染色阴性，严格有氧。4)功能特性寡氧单胞固氮菌株系SI-NJAU-1具有较高的固氮酶活性、可分泌较多吲哚乙酸(IAA)、较高解磷活性等特点。当菌株被是放到自然环境中时，对人、动物和植物无害，不会污染环境。三、寡氧单胞固氮菌株系SI-NJAU-1的16SrDNA序列测序为了鉴定该菌的系统发育地位，对所分离的菌株16SrDNA序列进行测序。首先筛出该菌的单菌落，然后进行PCR特异性扩增，PCR扩增产物在1.0％的琼脂糖凝胶电泳上检验后，用于序列测定，测序结果如SEQIDNO:1所示：从GenBank数据库中获取参比菌株，应用软件MegAlign对分离菌株和参比菌株的16SrDNA部分序列进行了分析，构建了分离菌株与标准菌株的系统发育关系图，得到反映待测菌株与参比菌株之间进化与发育关系的系统发育树，从而确定分离出来的寡氧单胞固氮菌株系SI-NJAU-1为寡氧单胞菌属(Stenotrophomonas)的新菌株。本专利技术所述的寡氧单胞固氮菌株系SI-NJAU-1在促进菊芋生长、提高菊芋生物量中的应用。本专利技术所述的寡氧单胞固氮菌株系SI-NJAU-1在改善菊芋氮营养，从而促进菊芋生长中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术的寡氧单胞固氮菌株系SI-NJAU-1具有较高的固氮酶活性、可分泌较多吲哚乙酸(IAA)、较高解磷活性等特点，接种该菌能够提高菊芋生物量，可用于实际生产。通过接种本专利技术的寡氧单胞固氮菌株系SI-NJAU-1，能达到改善菊芋氮营养，从而促进菊芋生长的目的。附图说明图1、寡氧单胞固氮菌株系SI-NJAU-1在JNFB培养基上的菌落形态图2、寡氧单胞固氮菌株系SI-NJAU-1的16SrDNA部分序列分析系统发育树状图图3、不同氮素营养水平下接种寡氧单胞固氮菌株系SI-NJAU-1对菊芋生物量的影响LN:低氮素营养液；MN:中氮素营养液；WN：不施加氮素，使用水浇灌，每隔3天浇一次，图中的数据是具有标准误差的五个生物学重复的平均值.图4、不同氮素营养水平下接种寡氧单胞固氮菌株系SI-NJAU-1对菊芋氮含量的影响a图是接种SI-NJAU-1后菊芋蛋白质含量；b图是接种SI-NJAU-1后菊芋硝态氮的含量；c图是接种SI-NJAU-1后菊芋硝酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种寡氧单胞固氮菌株系SI‑NJAU‑1，于2019年4月28号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No：17643。

【技术特征摘要】
1.一种寡氧单胞固氮菌株系SI-NJAU-1，于2019年4月28号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo：17643。2.权利要求1所述的寡氧单胞固氮菌株系...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁明祥，周梦佳，
申请(专利权)人：南京农业大学，南京洁沃士环保科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32