本发明专利技术涉及生物医药技术领域，特别涉及杜拉鲁肽与纳豆激酶的融合蛋白及其应用。本发明专利技术利用植物例如生菜作为重组蛋白质生产的有效表达平台，利用简单以及高效的表达体系生产生物活性物质。随后将生产该活性物质的叶片冻干制成胶囊。此胶囊可以在常温保存而保持生物活性。利用Western Blot蛋白杂交法确定降糖活性蛋白成功表达。生物活性测试结果表明利用该平台技术生产的降糖胶囊显著降低了狗血液中的血糖浓度。
Application of plant-produced oral Dularutin and Nattokinase Hypoglycemic Capsules
【技术实现步骤摘要】
植物生产口服杜拉鲁肽与纳豆激酶降糖胶囊的应用
本专利技术涉及生物医药
，特别涉及植物生产口服杜拉鲁肽与纳豆激酶降糖胶囊的应用。
技术介绍
糖尿病是以慢性高血糖为特征的常见病、多发病，是由体内胰岛素分泌或作用缺陷，或二者同时存在而引起的糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱。临床上主要有胰岛素依赖型(IDDM，I型)和非胰岛素依赖型(NIDDM，II型)两种类型。随着生活水平提高，无论在发达国家还是在发展中国家，糖尿病的发病率都在逐年上升。糖尿病作为一种严重的非传染性慢性疾病现已成为全世界各国密切关注的重大公共卫生问题之一，是全球范围内继心血管和肿瘤疾病之后的第三号杀手。从世界卫生组织公布的数据来看，1995年全球糖尿病患者仅3000万人左右，而到了1997年已增至1.35亿，到2030年将有3亿II型糖尿病患者，患者增幅最快的地区为亚洲和非洲。II型糖尿病患者的传统治疗模式一般是遵循饮食控制、口服抗糖尿病药物和外源性胰岛素的阶梯式治疗。但目前糖尿病治疗领域仍存在着诸多尚待解决的重要问题，而且还存在一些副作用和限制。胰高血糖素样肽-1(Glucagon-likepeptide-1,GLP-1)是由肠道内分泌细胞分泌的肠降血糖素，是胰高血糖素原基因翻译后加工产物，在体内有多种存在形式。它具有以下生理作用：以葡萄糖依赖方式作用于胰岛β细胞，促进胰岛素基因的转录，增加胰岛素的生物合成和分泌；刺激β细胞的增殖和分化，抑制β细胞凋亡，从而增加胰岛β细胞数量，抑制胰高血糖素的分泌，抑制食欲及摄食，延缓胃内容物排空等。这些功能都有利于降低餐后血糖并使血糖维持在恒定水平。尽管天然GLP-1在治疗糖尿病上有诸多优点，但它的体内半衰期仅为2分钟左右，限制了其在临床上的直接应用。而将天然的GLP-1中的某些氨基酸突变后可以在保证其活性的条件下延长它的半衰期，做到每周一次给药就可以保持正常的血糖水平。目前已经上市的相关产品有Liraglutide、Dulaglutide、Semaglutide等。由于多肽类药物本身的性质以及人体对其产生的各种屏障，其常规给药途经一直以注射为主。长期频繁注射给药给病患造成了身体和精神上的双重痛苦，因此，提供一种治疗糖尿病的口服制剂具有重要的现实意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供植物生产口服降糖胶囊的应用。本专利技术利用植物尤其是生菜作为重组蛋白生产的高效平台技术，表达了杜拉鲁肽(Dulaglutide)与纳豆激酶的融合蛋白。并且制成口服降糖胶囊。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了杜拉鲁肽(Dulaglutide)与纳豆激酶的融合蛋白，其具有：(Ⅰ)、如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列；或(II)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或(III)、与(Ⅰ)或(II)所述序列至少有80％同源性的氨基酸序列。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个或32个。本专利技术还提供了编码所述融合蛋白的核苷酸，具有(Ⅰ)、如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；或(II)、如SEQID2所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(II)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(II)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或(Ⅳ)、与(Ⅰ)、(II)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)、(II)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(V)、与(Ⅰ)、(II)、(Ⅲ)或(Ⅳ)所述核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个或32个。本专利技术还提供了表达载体，包括所述的核苷酸以及待转化载体。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述待转化载体为叶绿体表达载体。在上述研究的基础上，本专利技术还提供了所述的表达载体的构建方法，包括如下步骤：步骤1：分别将所述杜拉鲁肽(Dulaglutide)与纳豆激酶的融合蛋白的密码子优化为植物偏好的密码子，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；步骤2：将所述核苷酸序列克隆到pUC57载体中，获得pUC57-Dul。本专利技术还提供了所述的表达载体或植物在表达杜拉鲁肽(Dulaglutide)与纳豆激酶的融合蛋白或制备包含所述融合蛋白的药物中的应用；所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述药物为口服降糖制剂。此外，本专利技术还提供了宿主，转化有所述表达载体的植物或微生物；所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。本专利技术还提供了药物，包括所述的融合蛋白以及药学上可接受的辅料。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述药物为口服降糖制剂。此外，本专利技术还提供了一种植物作为宿主表达Dulaglutide与纳豆激酶的融合蛋白的方法，将所述的表达载体用基因枪轰击叶片，在植物叶绿体中表达后获得再生植株，将植物叶片冻干粉碎灌装胶囊，制成降糖胶囊。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述基因枪轰击包括如下步骤：步骤1：准备转化用载体；步骤2：准备微粒子弹；步骤3：基因枪轰击；步骤4：转换后培养、再生为植株。植物叶绿体表达技术是利用基因枪轰击、同源重组的方式将含有目标蛋白的质粒转移到植物叶绿体中，获得该基因植物叶绿体中高效表达的技术。与动物细胞表达系统相比，植物表达系统的成本非常低，仅为其千分之一到千分之二。本专利技术将杜拉鲁肽(Dulaglutide)与纳豆激酶融合表达，同样实现在口服给药，减轻病患长期频繁注射带来的痛苦。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示载体pUC57-Dul示意图；图2示western-blot结果；其中，泳道1示非表达植株；泳道2示生菜生产杜拉鲁肽(Dulaglutide)与纳豆激酶融合蛋白。具体实施方式本专利技术公开了植物作为宿主在表达杜拉鲁肽(Dulaglutide)与纳豆激酶的融合蛋白的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术提供了植物作为宿主在表达杜拉鲁肽(Dulaglutide)与纳豆激酶的融合本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.杜拉鲁肽与纳豆激酶的融合蛋白，其特征在于，其具有：(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或(II)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或(III)、与(Ⅰ)或(II)所述序列至少有80％同源性的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.杜拉鲁肽与纳豆激酶的融合蛋白，其特征在于，其具有：(Ⅰ)、如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列；或(II)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或(III)、与(Ⅰ)或(II)所述序列至少有80％同源性的氨基酸序列。2.编码如权利要求1所述融合蛋白的核苷酸，其特征在于，具有(Ⅰ)、如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；或(II)、如SEQID2所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(II)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(II)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或(Ⅳ)、与(Ⅰ)、(II)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)、(II)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(V)、与(Ⅰ)、(II)、(Ⅲ)或(Ⅳ)所述核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列。3.表达载体，其特征在于，包括如权利要求2所述的核苷酸以及待转化载体。...
【专利技术属性】
技术研发人员：王跃驹，
申请(专利权)人：王跃驹，
类型：发明
国别省市：美国,US
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